一种生物膜的制备方法及其产品和应用技术

本发明专利技术提出了一种生物膜的制备方法及其产品和应用。所述生物膜的制备方法包括以下步骤：(1)采用胶原酶抑制剂处理动物腔道组织；(2)去除占动物腔道组织总脂肪含量40％以上的膜层；(3)采用第一酶溶液处理步骤(2)得到的产物；(4)采用碱溶液处理步骤(3)得到的产物；(5)采用脱细胞溶液处理步骤(4)得到的产物；(6)采用脱脂液溶液处理步骤(5)得到的产物；(7)采用第二酶溶液处理步骤(6)得到的产物；(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜。本发明专利技术可极大程度地保留了生物膜的多层空间结构、弹性纤维及胶原网状结构的完整性，机械强度高，能去除产品中有机物和试剂的残留，使其诱导组织再生效果更好。使其诱导组织再生效果更好。使其诱导组织再生效果更好。

【技术实现步骤摘要】
一种生物膜的制备方法及其产品和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种生物膜的制备方法及其产品和应用，尤其涉及一种基于动物腔道组织的多层结构天然生物膜的制备及其在引导组织再生中的应用。

技术介绍

[0002]组织工程技术的进步和发展为泌尿系统重建、消化系统重建、女性生殖道重建等重要组织器官的修复提供了希望。组织工程技术包含支架材料、种子细胞和生长因子等领域。细胞外基质是较好的支架材料，细胞外基质含有的胶原网状结构和弹性纤维等利于细胞黏附生长，具有良好的临床应用前景。近年来，许多研究利用生物酶和试剂除去膀胱、真皮组织中的细胞和细胞碎片，留下细胞外基质，成为无细胞和富含胶原蛋白、弹性蛋白、弹性纤维、血管框架的基质结构。这种材料具有良好的生物相容性和机械稳定性，免疫原性相对较低，从而为细胞再生提供了一个良好的支架，营造了细胞再生所需的优良微环境。
[0003]CN107397978A公开了一种动物腔道组织脱细胞基质的制备方法，取动物腔道组织的粘膜下层，经过病毒灭活步骤、脱脂步骤以及脱细胞步骤制得，其中，所述脱细胞步骤包括多次冻融步骤以及所述多次冻融步骤之后的脱细胞溶液脱细胞步骤。该方法存在脱细胞和脱脂处理的方式存在用药量过大、脱细胞不彻底、用药毒性大残留多、制备材料机械性能低的问题。
[0004]CN106256382A公开了一种制备膀胱膜生物支架的方法，包括：(1)用NaOH处理膀胱组织；(2)用TritonX
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100和SDS以任意顺序处理所得物，并重复一遍该步骤；(3)用NaOH处理所得物；(4)将所得物低温干燥。该方法同样存在脱细胞和脱脂处理的方式存在用药量过大、脱细胞不彻底、用药毒性大残留多、制备材料机械性能低的问题；而且由于部分保留肌肉层，但是受脂肪影响，制备时间极长(完成流程需45天才能制备得到)。
[0005]CN107164298A公开了一种软组织去细胞基质的制备方法，涉及临床医学、生物医学与再生医学
，本专利技术提供的一种软组织去细胞基质的制备方法，使用超临界流体技术制备天然软组织去细胞基质。本专利技术提供的软组织去细胞基质的制备方法，对软组织基质成分的破坏更小，获得的软组织去细胞基质的免疫原性低，生物相容性好。
[0006]因此，开发一种能最大程度地保留了生物膜的多层空间结构、弹性纤维及胶原网状结构的完整性的生物酶制备方法是本领域研究的重点。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种生物膜的制备方法及其产品和应用，特别是提供一种富含多层结构的生物膜的制备方法及其产品和应用。本专利技术所述制备方法可极大程度地保留了生物膜的多层空间结构、弹性纤维及胶原网状结构的完整性，机械强度高，并能去除产品中有机物和试剂的残留，使其诱导组织再生效果更好；且制备富含多层结构的生物膜的整体耗时极短，仅需7天以内。
[0008]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供一种生物膜的制备方法，所述生物膜的制备方法包括以下步骤：
[0010](1)采用胶原酶抑制剂处理动物腔道组织；
[0011](2)去除占动物腔道组织总脂肪含量40％以上的膜层；
[0012](3)采用第一酶溶液处理步骤(2)得到的产物；
[0013](4)采用碱溶液处理步骤(3)得到的产物；
[0014](5)采用脱细胞溶液处理步骤(4)得到的产物；
[0015](6)采用脱脂液溶液处理步骤(5)得到的产物；
[0016](7)采用第二酶溶液处理步骤(6)得到的产物；
[0017](8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜。
[0018]本专利技术使用胶原酶抑制剂处理以保护腔道组织材料的胶原纤维，然后通过物理方法(机械切除法)去除腔道组织结构中高比例的脂肪，该步骤可去除占动物腔道组织总脂肪含量40％以上的(优选为40
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60％，该含量为质量百分含量)的脂肪，此外，由于大部分动物腔道组织具有致密的浆膜层结构，物理去除致密的浆膜层后可提高脱细胞和进一步化学脱脂的效率，大大节省生物膜制备时间。本专利技术选用温和、毒性低的试剂按顺序进行脱细胞和脱脂步骤，减小试剂对生物膜的破坏，采用酶法去除杂蛋白、核酸和多糖等能引起免疫反应的物质，并引入超临界CO2流体萃取技术，去除产品中有机物和所用试剂的残留，一方面极大程度地保留了生物膜的多层空间结构、弹性纤维及胶原网状结构的完整性，机械强度高，另一方面通过引入无毒环保的临界CO2流体萃取技术，去除产品中有机物和试剂的残留，使其诱导组织再生效果更好。
[0019]其中，步骤(1)中使用胶原酶抑制剂处理，胶原酶依赖一些金属离子如钙、锌、镁维持正常结构与功能，当这些离子被胶原酶抑制剂络合后，就可抑制胶原酶的活性，使胶原蛋白不受损，从而对动物腔道组织材料中的胶原纤维起到保护作用，避免后续机械、化学过程中机械升温和化学试剂对胶原纤维的结构产生影响。研究发现，动物腔道组织中大部分脂肪聚集在浆膜及浆膜下层，因此步骤(2)中采用机械切除方式除去动物腔道的浆膜及浆膜下层，可去除占比为40％以上的(优选为40
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60％，该含量为质量百分含量)的脂肪，这可以为进一步化学脱脂提供一定的基础，且去除致密的浆膜层，有利于酶溶液、脱细胞试剂和清洗剂等进入组织内壁，大大提高了肌肉细胞、杂蛋白、杂质和其他免疫原性成分的脱除效率，从而显著降低生物膜制备时间(由现有技术的50天作用直接减少至7天以内)。
[0020]其中，步骤(3)～(7)按照采用第一酶溶液处理、碱溶液处理、脱细胞溶液处理、脱脂液溶液处理、第二酶溶液处理的顺序。其原因是：使用第一酶溶液可起到消化肌肉细胞间连接的作用，有助于肌肉细胞裂解，并通过碱溶液作用疏松动物腔道组织壁中的胶原纤维，使脱细胞溶液能够有效进入组织壁中与细胞膜上的磷脂结合，使细胞破裂，达到彻底脱除肌肉细胞和细胞碎片的目的。将细胞脱除后，材料孔径变得疏松，使得脱脂液能有效进入组织孔隙中，高效去除组织内壁残留的脂肪。最后，使用第二酶溶液能够去除支架材料中残留的杂蛋白、多糖及核酸，有利于降低材料的免疫原性。以上方法能够尽量减少药量，进一步避免用药毒性大残留多，制备的材料机械性能低的问题，并且最大程度地保留了生物膜的多层空间结构、弹性纤维及胶原网状结构的完整性。
[0021]其中，步骤(8)采用采用超临界二氧化碳清洗，超临界流体萃取技术(Supercritical Fluid Extraction，SFE)是一种发展快，运用广的新型分离技术，具有操作简单、能耗少、无污染、分离效果好、成本低、无溶剂残留等优点。基于目前超临界CO2流体萃取技术这些优点，本专利技术将超临界CO2流体萃取技术应用于动物腔道组织多层结构天然生物膜制备过程中的清洗，以达到去除有机溶剂和试剂的残留，同时进一步去除一些多糖等具有免疫原性的物质，能够提高多层结构天然生物膜诱导组织再生的诱导活性。
[0022]优选地，步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物膜的制备方法，其特征在于，所述生物膜的制备方法包括以下步骤：(1)采用胶原酶抑制剂处理动物腔道组织；(2)去除占动物腔道组织总脂肪含量40％以上的膜层；(3)采用第一酶溶液处理步骤(2)得到的产物；(4)采用碱溶液处理步骤(3)得到的产物；(5)采用脱细胞溶液处理步骤(4)得到的产物；(6)采用脱脂液溶液处理步骤(5)得到的产物；(7)采用第二酶溶液处理步骤(6)得到的产物；(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜。2.根据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述动物腔道组织包括依次层叠的浆膜层、浆膜下层、肌肉层、粘膜下层和粘膜层；优选地，步骤(1)中，所述动物腔道组织选自动物食道组织、动物胃组织、动物肠道组织、动物尿道组织或动物膀胱组织中的任意一种；优选地，步骤(1)中，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合；优选地，步骤(1)中，所述处理具体为：将动物腔道组织浸泡于胶原酶抑制剂的水溶液中进行处理；优选地，所述胶原酶抑制剂的水溶液的质量浓度为1
‑
20wt％；优选地，所述动物腔道组织和胶原酶抑制剂的水溶液的质量比为1:(5
‑
15)；优选地，所述浸泡的温度为20
‑
30℃，所述浸泡的时间为1
‑
6h。3.根据权利要求1或2所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述去除采用机械切割设备切除、剪刀修剪、手工剥离或物理打磨中的任意一种，优选为机械切割设备切除；优选地，所述机械切割设备切除的方法具体工艺参数包括：电压160
‑
265V，功率1200
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4000W，切割速率5
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40mm/s，切割后材料表面粗糙度<100μm；优选地，步骤(2)中，所述去除为去除占动物腔道组织总脂肪含量40
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60％的膜层，优选为44
‑
52％；优选地，步骤(2)中，所述去除的膜层包括浆膜层和浆膜下层；优选地，步骤(2)中，所述去除的膜层还包括部分肌肉层；优选地，步骤(2)中，所述去除的膜层为浆膜层和浆膜下层，得到的产物为肌肉层、粘膜下层和粘膜层；所述去除的膜层为浆膜层、浆膜下层和部分肌肉层，得到的产物为剩余的肌肉层、粘膜下层和粘膜层；优选地，步骤(2)去除的膜层的总厚度为1
‑
3mm。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述第一酶溶液包括胰蛋白酶溶液和/或1398蛋白酶溶液；优选地，步骤(3)中，所述第一酶溶液的浓度为0.1
‑
5wt％；优选地，步骤(3)中，所述处理采用浸泡的方式进行，所述浸泡的温度为20
‑
30℃，所述浸泡的时间为1
‑
8h；优选地，步骤(4)中，所述碱溶液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液或氢氧
化钙溶液中的任意一种或至少两种的组合；优选地，步骤(4)中，所述碱溶液的浓度为0.1
‑
5mol/L；优选地，步骤(4)中，所述碱溶液中还包括1
‑
5wt％的胶原酶抑制剂；优选地，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合；优选地，步骤(4)中，所述处理采用浸泡的方式进行，所述浸泡的温度为4
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25℃，所述浸泡的时间为1
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4h。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述脱细胞溶液包括表面活性剂的水溶液；优选地，所述表面活性剂包括吐温、十二烷基氨基丙酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚或烷基酚聚氧乙烯醚中的任意一...

【专利技术属性】
技术研发人员：董群，任恒飞，胡夏练，
申请(专利权)人：吾奇生物医疗科技江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：