本公开中提供了一种蛋白质亲和纯化方法。具体而言，本公开提供了包括如下步骤的蛋白质亲和纯化方法：(a)用洗脱前处理缓冲液淋洗上样后的亲和层析柱；以及(b)用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白；其中，所述洗脱前处理缓冲液的缓冲能力高于所述洗脱缓冲液的缓冲能力。本公开还提供了与该方法对应的产品。采用本公开的方法和产品可提高洗脱产品的pH环境，有效提高下游工艺的稳健性且易于放大，从而可广泛应用于蛋白质(例如抗体类)药物的纯化。白质(例如抗体类)药物的纯化。
【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质亲和纯化方法
[0001]本专利技术属于蛋白质纯化和分离
具体而言，本专利技术涉及一种新型的蛋白质亲和纯化工艺，其尤为适于对低pH敏感的蛋白质的纯化。
技术介绍
[0002]抗体类药物中所存在的多聚体主要产生于细胞培养、蛋白质纯化以及制剂储存过程中。这些存在于抗体类药物中的多聚体在抗体类药物施用时有可能会引起受体的免疫原反应。由此，多聚体被相关监管机构乃至整个抗体类药物行业公认为抗体类药物产品的一个重要质量指标。
[0003]由于下游分离纯化工艺对于去除和控制多聚体含量具有更高的灵活性和可操作空间，使得其成为去除多聚体的主力。目前的下游纯化工艺主要依靠精纯步骤来去除多聚体，例如包括离子(阴离子或阳离子)交换层析、疏水层析等方式。
[0004]在常规操作中，亲和层析的主要功能是从发酵液中直接捕获产品，而通常不具备去除多聚体的能力。不仅如此，亲和层析中剧烈的低pH洗脱条件还有可能诱导形成多聚体，且这一影响在大规模生产中可能被放大。
[0005]目前，抗体类药物(包括单抗、FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)纯化过程中，主要以Protein A填料亲和捕获目标蛋白后再进行低pH洗脱作为工艺的第一步。例如，传统的亲和层析层析仅仅作为捕获步骤，一般采取低pH洗脱(低于pH 3.8)，洗脱产品的pH在4.0左右。但是低pH洗脱条件，容易诱导多聚体的产生甚至使得目标蛋白失活，因而不仅不适用于低pH敏感型蛋白质，也不利于杂质的去除，给后续的精纯和工艺的稳健性也增加了难度。
[0006]近年来，随着生物药物种类增加和复杂性提高，出现了越来越多对于剧烈的低pH洗脱条件敏感型的生物分子。而针对低pH敏感型蛋白质，目前主要是采用两种策略：第一种是放弃传统的protein A亲和工艺，采用其他层析模式，这种层析模式有可能会引入额外的层析和换液工艺使得锁定的工艺更加复杂；第二种是在洗脱液中加入中性的中和缓冲液，使得洗脱的pH快速的提高，该方法因为洗脱液pH在不同规模的不确定性，而不容易放大，且工艺稳健性存在风险。
[0007]本领域中迫切需要开发出新的纯化方法，来有效去除抗体类药物中的多聚体，并避免剧烈低pH洗脱条件对目标分子的影响。
技术实现思路
[0008]本专利技术正是针对现有技术中的上述技术难题，对亲和纯化工艺进行了系统优化，创新性地通过采用洗脱pH偏移的策略，提高了洗脱产品的pH环境，有效提高下游工艺的稳健性。该工艺策略打破了传统观念，工艺稳健且易于放大，已在30L生产规模上完成验证，可广泛应用于抗体类药物的纯化。
[0009]在本专利技术的第一方面中，提供了一种蛋白质亲和纯化方法，所述方法包括如下步骤：
[0010](a)用洗脱前处理缓冲液淋洗上样后的亲和层析柱；以及
[0011](b)用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白；
[0012]其中，所述洗脱前处理缓冲液的缓冲能力高于所述洗脱缓冲液的缓冲能力。
[0013]在一些实施方式中，洗脱缓冲液的缓冲能力低于同摩尔浓度的醋酸钠或醋酸
‑
醋酸钠洗脱缓冲液。
[0014]在一些实施方式中，洗脱前处理缓冲液的pH值比洗脱缓冲液的pH值至少高2.0。
[0015]在一些实施方式中，所述蛋白质亲和纯化选自：Protein A亲和层析、Protein G亲和层析和Protein A/G亲和层析。
[0016]在一些实施方式中，所述目标蛋白为包含Fc区段的蛋白质分子。在一些实施方式中，所述目标蛋白为抗体，如多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或Fc融合蛋白等。
[0017]在一些实施方式中，所述目标蛋白对低pH敏感和/或在常规低pH洗脱中易于产生多聚体。
[0018]在一些实施方式中，所述洗脱前处理缓冲液的pH范围为5.5
‑
8.5。
[0019]在一些实施方式中，所述洗脱前处理缓冲液的pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5，优选7.0
‑
7.5。
[0020]在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液的pH范围为3.0
‑
4.5，例如3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5。
[0021]在一些实施方式中，所述洗脱前处理缓冲液的pH值比所述洗脱缓冲液的pH值高2.0～4.5，例如高2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5。
[0022]在一些实施方式中，所述洗脱前处理缓冲液选自：Bis
‑
Tris缓冲体系、Tris缓冲体系(如Tris
‑
HCl缓冲体系)、MES缓冲体系、醋酸
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醋酸钠缓冲体系、醋酸钠缓冲体系、组氨酸缓冲体系、柠檬酸缓冲体系、磷酸缓冲体系。
[0023]在一些实施方式中，当洗脱缓冲液为组氨酸缓冲体系时，所述洗脱前处理缓冲液不是组氨酸缓冲体系或具有与洗脱缓冲液不同的pH。
[0024]在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液选自：氨基酸缓冲体系。
[0025]在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液体系选自：Leu、Gly、Val、Thr、Met、Asn、Phe、Trp、His、Glu、Gln、Ser、Arg和Ala缓冲体系。
[0026]在一些实施方式中，所述洗脱前处理缓冲液中还包含添加剂，例如氯化钠、氯化钾、硫氰酸钠、硫氰酸钾、精氨酸盐酸、组氨酸、咪唑等。
[0027]在一些实施方式中，所述添加剂的浓度为0
‑
2M，例如0
‑
0.1M、0
‑
0.2M、0
‑
0.5M、0
‑
1M、0
‑
1.5M、0
‑
1.8M、0
‑
2M。
[0028]在一些实施方式中，相较于采用pH 3.5的对照醋酸
‑
醋酸钠洗脱体系，所述方法：提高了洗脱产物的pH(例如使得洗脱产物的pH升高至少0.5，例如升高0.5
‑
3)、降低了目标蛋白在低pH洗脱下的降解、减少了亲和纯化洗脱中的多聚体形成、降低了洗脱产物的电导率(例如使得洗脱产物的电导率降低至少0.3mS/cm，例如降低0.3
‑
4mS/cm)、维持或提高了目标蛋白收率和/或有利于后续精纯步骤。
[0029]在一些实施方式中，，所述方法还包括上样前步骤(例如柱平衡、消毒)、洗脱后样品处理步骤、洗脱后柱处理步骤等常规步本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种蛋白质亲和纯化方法，所述方法包括如下步骤：(a)用洗脱前处理缓冲液淋洗上样后的亲和层析柱；以及(b)用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白；其中，所述洗脱前处理缓冲液的缓冲能力高于所述洗脱缓冲液的缓冲能力。2.如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述蛋白质亲和纯化选自：Protein A亲和层析、Protein G亲和层析和Protein A/G亲和层析。3.如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述目标蛋白为包含Fc区段的蛋白质分子，例如所述目标蛋白为：抗体，如多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或Fc融合蛋白等；和/或所述目标蛋白为对低pH敏感和/或在常规低pH洗脱中易于产生多聚体的蛋白质。4.如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述洗脱前处理缓冲液的pH范围为5.5
‑
8.5，例如5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5，优选7.0
‑
7.5；和/或所述洗脱缓冲液的pH范围为3.0
‑
4.5，例如3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5；和/或所述洗脱前处理缓冲液的pH值比所述洗脱缓冲液的pH值高2.0～4.5，例如高2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5。5.如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述洗脱前处理缓冲液选自：Bis
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Tris缓冲体系、Tris缓冲体系(如Tris
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HCl缓冲体系)、MES缓冲体系、醋酸
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醋酸钠缓冲体系、醋酸钠缓冲体系、组氨酸缓冲体系、柠檬酸缓冲体系、磷酸缓冲体系，其中，当洗脱缓冲液为组氨酸缓冲体系时，所述洗脱前处理缓冲液不是组氨酸缓冲体系或具有与洗脱缓冲液不同的pH。6.如权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：林森珠，杨富豪，费丽，林世文，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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