一种通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法技术

一种通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，首先以新冠病毒N蛋白为模板，以羧基化的碳纳米管为载体，以丙烯酰胺为功能单体通过聚合反应制备新冠病毒蛋白选择性吸附材料，用于富集环境中新冠病毒N蛋白及其相连核酸，对富集核酸进行提取后再通过逆转录PCR方法检测新冠病毒。本发明专利技术材料对新冠病毒蛋白具有较高的吸附能力，吸附量达88

【技术实现步骤摘要】
一种通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法


[0001]本专利技术涉及一种选择性吸附核蛋白(N蛋白)的功能材料的制备及其用于环境中低浓度新冠病毒的检测方法；该功能材料利用分子印迹选择性识别模板的特性制备，能够选择性吸附环境中的新冠病毒N蛋白，同时富集与N蛋白相连的新冠病毒游离核酸，通过对N蛋白和核酸的后续检测分析，以实现环境中新冠病毒的高效检测。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
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2)导致的新型冠状病毒肺炎(COVID
‑
19)疫情在全球的蔓延已经波及绝大多数国家和地区，感染人数已达一亿八千万，为公共健康和人类发展带来巨大灾难。除在人群中感染，在环境样品中检出新冠病毒的情况逐渐增加，环境中新冠病毒再次感染人群的案例也越来越多，已经成为新冠病毒传播的一种主要形式。因此，开展环境中新冠病毒的检测至关重要。
[0003]当前新冠病毒检测手段主要针对人体，包括核酸检测方法，免疫学检测方法和病毒分离鉴定等。核酸检测准确率很高，在感染早期即可呈现阳性，但检测程序复杂、费时，对于样品的保存，核酸提取，操作人员的熟练程度以及操作环境都有较高的要求。酶联免疫吸附剂测定法是利用抗原与抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法，如专利“一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法”(申请号CN202011460161.0)公开了一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括各自独立包装的试剂1与试剂2，试剂2至少包括包被有新冠蛋白的胶乳微粒，用于与被测样本中的新型冠状病毒抗体发生抗原抗体反应。但该方法准确率受限且检测较慢，常不能实现早期诊断。病毒分离方法需要数天培养，特异性和敏感性都会低于核酸检测法。而且，上述方法都主要用于人体中新冠病毒的检测，而环境中新冠病毒普遍浓度很低，而且污染介质复杂、影响因素众多，导致上述方法的可用性进一步降低。开发一种简便、快速、识别能力强、灵敏度高，适用于环境中新冠病毒检测的方法有着重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于制备一种选择性吸附新冠病毒核蛋白(N蛋白)的功能材料，并利用其检测环境中低浓度新冠病毒。该材料对新冠病毒N蛋白具有较高的吸附能力和特异性，能够有效富集环境中的新冠病毒N蛋白及其相连核酸，实现对环境中低浓度新冠病毒的特异性检测。本专利技术的技术方案为：首先以新冠病毒N蛋白为模板，以羧基化的碳纳米管为载体，以丙烯酰胺为功能单体通过聚合反应制备新冠病毒蛋白选择性吸附材料，用于富集环境中新冠病毒N蛋白及其相连核酸，对富集核酸进行提取后再通过逆转录PCR方法检测新冠病毒。具体方案如下：
[0005]1)将羧基化碳纳米管(CNTs
‑
COOH)溶于去离子水，超声分散为稳定悬浊液，加入N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚胺盐酸盐(EDAC)振荡后离心后清洗沉淀；CNTs
‑
COOH和NHS
的质量比在(3～12):1，CNTs
‑
COOH和EDAC的质量比在(5～20):1；
[0006]2)将步骤1)中的沉淀溶于含市售新冠病毒表面蛋白的缓冲溶液，2～8℃下充分振荡，加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液，充分振荡后离心，去离子水清洗沉淀；CNTs
‑
COOH和新冠病毒表面蛋白的质量比在(25～100):1；CNTs
‑
COOH和Tris的质量比为(0.1～0.5):1；
[0007]3)将步骤2)中的沉淀在PIPES溶液中重悬后，加入丙烯酰胺(AAM)充分振荡，随后加入N,N
’‑
亚甲基双丙烯酰胺(NNMBA)和硫代硫酸盐，振荡3
‑
6小时后离心，去离子水清洗沉淀。CNTs
‑
COOH和AAM的质量比在(0.5～2):1；CNTs
‑
COOH和NNMBA的质量比在(0.2～1):1；CNTs
‑
COOH和硫代硫酸盐的质量比在(3～15):1。
[0008]4)将步骤3)中的沉淀加入弱酸溶液振荡3
‑
12h后充分清洗，干燥后得到新冠病毒蛋白印迹材料MIP；
[0009]5)将步骤4)中制备的MIP浸入待检测的环境样本中搅拌10
‑
30min后离心将MIP分离；随后将离心获得的MIP加入至市售RNA提取试剂盒提取富集的新冠病毒核酸；将提取的新冠病毒核酸通过市售逆转录PCR试剂盒扩增，检测新冠病毒的含量；加入至环境样本中的MIP的浓度为100
‑
1000mg/L。
[0010]优选步骤1)：上述步骤1)中CNTs
‑
COOH悬浊液的浓度优化为2
‑
20mg/mL；
[0011]优选步骤2)：上述步骤2)中新冠病毒N蛋白浓度优化为200
‑
300mg/L；缓冲溶液包括但不限于PIPES缓冲溶液或PBS缓冲溶液，浓度为0.01
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1mol/L；硫代硫酸盐优化为硫代硫酸钠、硫代硫酸钾和硫代硫酸铵；
[0012]优选步骤3)：上述步骤4)中弱酸优化为草酸或乙酸，浓度优化为0.5～2mol/L；
[0013]优选步骤4)：上述步骤5)中环境样本优化为水、土壤或空气样本，其中土壤或空气样本需首先将样本浸入水中使新冠病毒转移到水相后测定。
[0014]本专利技术有益效果是：
[0015]本专利技术中选择性吸附核蛋白的MIP材料对新冠病毒蛋白具有较高的吸附能力，吸附量达88
‑
140mg/g材料，可用于空气和水体等环境中新冠病毒的选择性吸附。
[0016]本专利技术中选择性吸附核蛋白的MIP材料对新冠病毒蛋白具有较快的吸附速率，一级动力学速率常数达0.00015
‑
0.00025/s，因此能在短时间吸附足够的新冠病毒蛋白用于后续的检测。
[0017]本专利技术提出的新冠病毒检测方法的灵敏度远高于常规的核酸检测方法，灵敏度是后者的65
‑
1000倍。
附图说明
[0018]图1：本专利技术的材料合成的技术路线图
[0019]图2：实施例1制备的材料的透射电镜图；
[0020]图3：实施例1制备的材料的红外光谱图；
[0021]图4：实施例1制备的材料和对照材料对新冠病毒表面蛋白的吸附对比图；
[0022]图5：实施例1制备的材料对新冠病毒表面蛋白的吸附等温线拟合图；
[0023]图6：实施例1制备的材料对新冠病毒表面蛋白的吸附一级动力学方程拟合图；
具体实施方式
[0024]下面结合附图对本专利技术具体的实施例进行详细描述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0025]图1所示的是本专利技术中选择性吸附核蛋白的MIP材料的合成路线本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，其特征在于：首先利用分子印迹选择性识别模板的特性，制备了一种新冠病毒N蛋白选择性吸附材料，进而用于利用此材料富集环境中新冠病毒N蛋白及其相连核酸，对富集核酸进行提取后再通过逆转录PCR方法检测环境中存在的新冠病毒；该新冠病毒N蛋白选择性吸附材料是以以新冠病毒N蛋白为模板，以羧基化的碳纳米管为载体，以丙烯酰胺为功能单体通过聚合反应制备得到。2.根据权利要求1所述的通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，其特征在于：新冠病毒N蛋白选择性吸附材料结构为内外两层，内层为碳纳米管，外层为聚丙烯酰胺聚合层，聚丙烯酰胺聚合层中镶嵌有病毒表面蛋白印迹；新冠病毒N蛋白选择性吸附材料的直径为10
‑
30nm，丙烯酰胺的质量占比为20％～25％；新冠病毒N蛋白选择性吸附材料对新冠病毒表面蛋白的吸附量达88
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140g/g，吸附动力学速率常数达0.00015
‑
0.00025/s。3.根据权利要求1或2所述的通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，其特征在于具体步骤如下：1)将羧基化碳纳米管CNTs
‑
COOH溶于水分散为稳定悬浊液，加入N
‑
羟基琥珀酰亚胺NHS和碳二亚胺盐酸盐EDAC振荡后离心，清洗后得到沉淀；CNTs
‑
COOH和NHS的质量比在(3～12):1，CNTs
‑
COOH和EDAC的质量比在(5～20):1；2)将步骤1)中的沉淀加入含新冠病毒N蛋白的缓冲溶液充分振荡，加入三羟甲基氨基甲烷Tris溶液，振荡后离心，清洗后得到沉淀，CNTs
‑
COOH和新冠病毒N蛋白的质量比在(25～100):1；CNTs
‑
COOH和Tris的质量比为(0.1～0.5):1；3)将步骤2)中的沉淀重悬后，加入丙烯酰胺AAM充分振荡，随后加入N,N
’‑
亚甲基双丙烯酰胺NNMBA和硫代硫酸盐，...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗义，袁青彬，胡文进，毛大庆，
申请(专利权)人：罗义，
类型：发明
国别省市：