一种血清中维生素K的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种血清中维生素K的测定方法。本发明专利技术综合考虑血清中维生素K萃取效率的影响所有影响因素，在液相色谱测定之前设计了前处理步骤；经过多次实验验证，本发明专利技术在流动相乙腈、乙酸乙酯、甲醇混合液中加入乙酸、乙酸钠和氯化锌，以催化维生素K同系物的母核萘醌环产生荧光。本发明专利技术与现有技术相比：同样的标准品，响应值相差2.5倍，噪音基本不变，即灵敏度提高2.5倍。且本发明专利技术在优化的色谱条件下，维生素K1、K2得到了良好的分离，标准品的检测限达到0.1μg/L。达到0.1μg/L。

【技术实现步骤摘要】
一种血清中维生素K的测定方法


[0001]本专利技术涉及一种测定血清中维生素K的方法,属于维生素检测


技术介绍

[0002]维生素 K 除了作为凝血必需的辅酶因子外，近年来越来越多的研究显示它在细胞信号转导、骨骼代谢等方面都发挥着重要作用。维生素K在酶促羧化反应中起辅助作用,例如谷氨酸羧化酶
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谷氨酸残基形成蛋白质中的
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羧谷氨酸；维生素K还可以降低血管钙化和骨质疏松的风险(基质Gla蛋白，骨钙素)，与“钙化段”相关。
[0003]维生素K1(vitaminK
1 )是一种脂溶性维生素，为黄色至橙黄色的透明粘稠液体，广泛存在于绿色植物中。作为肝脏凝血酶原形成的必需物质，维生素K2是一系列具有不同异戊二烯链的甲萘醌，溶于正己烷、乙酸乙酯等非极性溶剂，血液中的维生素K大多呈脂肪结合态，极少以游离状态存在，考虑到维生素K的存在状态，选择血清作为检测样本，分析其在人体内的含量水平、分布特征，以进一步探讨不同形态维生素 K 的生理功能、生物活性以及安全补充限量等提供可能。
[0004]近年来，维生素类物质的检测方法报道较多，如紫外检测法、荧光法、电化学法和质谱法等。维生素K的相关报道较少。目前，国内尚未有血清中维生素 K检测的相关标准，相关检测方法报道也较少，食品中维生素K的检测方法主要包括高效液相色谱－紫外检测法、毛细管电泳法、高效液相色谱－质谱法等，前处理采取的方法有直接萃取法和薄层纯化法，面对的样品主要是原料药、食品添加剂等基质较为干净、含量较高的样品。
[0005]维生素 K 的不饱和酮结构共轭体系较小，不能产生荧光，但能通过衍生法使维生素 K 同系物的母核萘琨环产生荧光，以提高其在高效液相色谱荧光检测器上的响应值，从而达到检测目的。另外，维生素K在血清中含量极少，且易受强酸、氧化剂、碱及光的作用而分解。并且，基质复杂、含量较低，大多以脂肪结合态存在，直接萃取或超滤等方法，萃取不完全、杂质干扰大，无法满足血清中维生素K高通量、高灵敏度检测的要求。因此有必要建立一种血清中维生素K的测定方法，以检测不同人群血清中维生素K的分型、含量水平、分布特征。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种血清中维生素K的测定方法，以弥补现有技术的不足。
[0007]本专利技术在现有的食品中维生素K1 检测技术之上基础上，重点针对基质复杂、含量水平相对较低、以脂肪结合态存在的血清样品为研究对象，探讨适宜的样品提取技术和色谱分离技术，以保证检测方法的灵敏性和准确性。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采取的具体技术方案为：一种血清中维生素K的测定方法，包括以下步骤：（1）获取待检测血清样本；（2）将血清样本进行检测前处理，且准备空白实验样本；
（3）液相色谱测定：检测仪器为液相色谱配荧光检测器，色谱条件为：a.色谱柱：ZORBAX C18柱，或等效色谱柱；b.流动相:乙腈+乙酸乙酯+甲醇+氯化锌+乙酸钠d.流速：1mL/min；e.柱温：30℃f.进样量：50μL；g.激发波长248nm，发射波长：418nm；（4）标准曲线制作；（5）对照标准曲线，计算血清维生素K含量。
[0009]进一步的，所述步骤（1）中，空腹静脉血，取血方法依据WS/T 225以及检测方法要求的采集方法；采集的血液样品经4000r/min离心10min，分离血清血浆，使用不同采血管分装；样品于2℃～8℃可稳定7天，
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20℃可稳定12个月；若标本不能及时检测，建议适量分装后于
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70℃存放标本，仅一次冻融；样品于检测前避光解冻至室温。
[0010]进一步的，所述步骤（2）具体为：确移取解冻至室温的试样，加入脂肪酶，混合后进行恒温振荡酶解，加入乙醇、50%氢氧化钾溶液，混合后加入正己烷，提取后离心，取上清液于一离心管中，下层再经正己烷重复提取，合并正己烷层于该离心管中，氮干，流动相复溶过膜后，进行液相色谱测定；将血清用紫外灯照射后，去除维生素K，按该前处理方法做空白试验。
[0011]进一步的，所述步骤（3）中，检测仪器为液相色谱配荧光检测器， C18柱，柱长150mm，内径4.6mm,粒径5μm或等效色谱柱，锌粉还原柱，50
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6mm，流动相：乙腈（含乙酸乙酯20%，甲醇10%，0.5g/L氯化锌，0.1mL/L乙酸，0.15g/L乙酸钠）；流速：1.5mL/min；检测波长：激发波长为248nm，发射波长为418nm；进样量：50μL。
[0012]进一步的，所述步骤（4）中，标准系列工作溶液浓度含维生素K1和四烯甲萘醌、七烯甲萘醌分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，按步骤（3）标准优化的色谱条件进样分析，以各组分的浓度的为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。其中，维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌检出限分别为0.20ng/mL、0.20ng/mL、0.50ng/mL，最低定量限分别为1.0ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL。
[0013]本专利技术的优点和技术效果：本专利技术综合考虑血清中维生素K萃取效率的影响所有影响因素，在液相色谱测定之前设计了前处理步骤；经过多次实验验证，本专利技术在流动相中加入乙酸、乙酸钠和氯化锌，以催化维生素K同系物的母核萘醌环产生荧光。本专利技术与现有技术相比：同样的标准品，响应值相差2.5倍，噪音基本不变，即灵敏度提高2.5倍。且本专利技术在优化的色谱条件下，维生素K1、K2得到了良好的分离，标准品的检测限达到0.1μg/L。
[0014]实验结果表明：在线性范围1.0ng/mL～20.0ng/mL内，线性关系良好(r≥0.995)；三个水平添加（2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL）回收率为80.0%～97.6%；对加标样品进行6次独立测定，其相对标准偏差均小于5%；维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌的最低定量限分别为1.0ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL。该方法操作简单，结果准确，重复性好，可用于血清中维生素K的定性定量分析。
附图说明
[0015]图1 维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌标准品色谱图。
[0016]图2 空白样品色谱图。
[0017]图3 空白加标（10ng/mL）样品色谱图。
[0018]图4 血清样品色谱图。
具体实施方式
[0019]以下通过具体实施例并结合附图对本专利技术进一步解释和说明。
[0020]实施例1：一种血清中维生素K的测定方法，包括以下步骤：（1）取样：空腹静脉血，取血方法依据WS/T 225以及检测方法要求的采集方法。采集的血液样品经4000r/min离心10min，分离血清血浆，使用不同采血管分装。样品于2℃～8℃可稳定7天，
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20℃可稳定12个月。若标本不能及时检测，建议适量分装后于
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70℃存放标本，仅一次冻融。样品于实验前避本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血清中维生素K的测定方法，其特征在于，该测定方法包括以下步骤：（1）获取待检测血清样本；（2）将血清样本进行检测前处理，且准备空白实验样本；（3）液相色谱测定：检测仪器为液相色谱配荧光检测器，色谱条件为：a.色谱柱：C18柱或等效色谱柱；b.流动相: 乙腈、乙酸乙酯、甲醇混合液；c.激发波长248nm，发射波长：418nm；（4）制作标准曲线；（5）对照标准曲线，计算血清维生素K含量。2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（1）中，空腹静脉血，取血方法依据WS/T 225以及检测方法要求的采集方法；采集的血液样品经离心后分离血清血浆。3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：确移取解冻至室温的试样，加入脂肪酶，混合后进行恒温振荡酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凤艳，蒋万枫，王海玲，盛杨，赵丹，郝爽，
申请(专利权)人：青岛市食品药品检验研究院青岛市药品不良反应监测中心，青岛市实验动物和动物实验中心，
类型：发明
国别省市：