本发明专利技术公开了一种检测膀胱癌的标志物及检测该标志物的引物对及其应用。所述标志物为包含如SEQ ID NO:1～5所示核苷酸序列的一种或多种葡萄球菌属(Staphylococcus)的16S rDNA序列。所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示。所述引物对可用于制备检测膀胱癌的试剂盒。本发明专利技术可用于膀胱癌筛查，从而实现无创低成本的膀胱癌诊断和监测，操作简单、灵敏度高、检测周期快，灵敏度和特异性分别达到75％和93.8％。性分别达到75％和93.8％。性分别达到75％和93.8％。
【技术实现步骤摘要】
检测膀胱癌的标志物及检测该标志物的引物对及其应用
[0001]本专利技术涉及医学生物检测领域，具体地，涉及一种检测膀胱癌的标志物及检测该标志物的引物对及其应用。
技术介绍
[0002]膀胱癌是男性中第四大常见的癌症(占男性实性恶性肿瘤的7％)，近10年来，伴随烟草消费增加、工业化水平提高以及人口老龄化，中国人膀胱癌的发病率不论是男性还是女性，都呈增长趋势。现有的膀胱癌诊断和监测的技术主要是膀胱镜检查和尿脱落细胞学检查，膀胱镜检查具有侵入性，脱落细胞学检查取材繁琐，不易获得满意的标本，临床应用少。
[0003]膀胱癌监测的金标准是白光内镜，然而，这个方法具有侵入性且较为昂贵，可导致病人显著不适，同时还由于需要在监测过程中反复的进行内镜检测，导致昂贵的费用支出。这些因素会导致膀胱癌病人的依从性降低。因此，应用方便准确的生物标记能够极大推动膀胱癌诊断和复发进展的监测过程。
[0004]尿液肿瘤标记物在概念上是非常适合进行监测的，因为尿液是直接与肿瘤相接触的，并且肿瘤会将代谢物释放到尿中。在低危膀胱癌中，生物标记物能够协助减少内镜的检测频率。而对于高危患者，生物标记能够更加及时地发现肿瘤的早期复发及进展。
[0005]目前针对膀胱癌尿液的研究主要集中在脱落细胞、尿上清cfDNA、microRNA、外泌体等生物标志物的筛查，而尿液菌群在泌尿系统肿瘤的作用是一个新兴的研究领域，尿液及膀胱在过去被认为是无菌的，但通过16S rDNA测序发现，尿液中有细菌存在。目前有限的通过尿液菌群筛查膀胱癌的文献报道中，提到的筛查方法都是基于测序，检测成本高，灵敏度和特异性低，例如张桂豪在《基于高通量测序技术膀胱癌的尿液菌群特征分析》(南方医科大学，硕士学位论文，2019年)发现葡萄球菌科在膀胱癌组与对照组中的丰度分别为12.2％与10.2％，但并未公开尿液中葡萄球菌的种属、检测其的目的基因及相应的引物对。
技术实现思路
[0006]为解决现有技术中缺少高灵敏度和高特异性的膀胱癌强相关性的尿液菌群检测标记物的技术问题，本专利技术提供了一种检测膀胱癌的标志物及检测该标志物的引物对及其应用。专利技术人通过qPCR技术对膀胱癌病人的尿液菌群DNA进行定量检测，筛选得到新的膀胱癌检测标志物，该标志物能够用于膀胱癌筛查，从而实现无创低成本的膀胱癌诊断和监测。
[0007]本专利技术的第一方面提供一种检测膀胱癌的标志物，所述标志物为包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的一种或多种葡萄球菌属(Staphylococcus)的16S rDNA序列。
[0008]优选地，所述的16S rDNA序列为如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
[0009]所述的葡萄球菌属例如：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.a)、表皮葡萄球菌
(Staphylococcus.e)和腐生葡萄球菌(Staphylococcus.s)等。
[0010]本专利技术的第二方面提供一种检测如第一方面所述的标志物的引物对，包括正向引物和反向引物。
[0011]所述的正向引物的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示，所述的反向引物的序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示。
[0012]优选地，所述的正向引物的序列如SEQ ID NO:8所示，反向引物的序列如SEQ ID NO:9所示。
[0013]本专利技术的第三方面提供一种葡萄球菌属(Staphylococcus)微生物的鉴定方法，包括以下步骤：
[0014]以已提取的DNA为模板，使用本专利技术第二方面所述的引物对进行扩增，当扩增结果为阳性时，则判定所述样品具有葡萄球菌属的微生物。
[0015]可选地，上述步骤之前还包括从样品中提取DNA的步骤。
[0016]优选地，所述扩增采用PCR、实时荧光定量PCR，所述实时荧光定量PCR优选包括使用SYBRGreen或探针。
[0017]使用所述的SYBRGreen进行实时荧光定量PCR的反应液体系包括SYBR Premix Ex Taq II、ROX Reference Dye、上游引物、下游引物、DNA模板和纯水。
[0018]其中，所述的上游引物的浓度为0.2～1.2μmol，下游引物的浓度为0.2～1.2μmol，DNA模板的浓度为0.8ng/μl。
[0019]优选地，所述的上游引物的浓度为1μmol，下游引物的浓度为1μmol，DNA模板的浓度为0.8ng/μl。
[0020]使用所述的SYBRGreen进行实时荧光定量PCR的反应条件可为本领域常规；优选地，所述反应条件可为95℃变性30秒，95℃退火5秒，60℃延伸30秒，循环数为30～50次，例如循环40次。
[0021]本专利技术的第四方面提供一种检测膀胱癌的试剂盒，其包括本专利技术第二方面所述的引物对。
[0022]所述试剂盒还包括探针或SYBRGreen、基因芯片；所述探针为可与所述引物对配合，从而可对所述16S rDNA序列进行定量分析的探针例如TaqMan探针。
[0023]其中，所述的上游引物的浓度为0.2～1.2μmol，下游引物的浓度为0.2～1.2μmol，DNA模板的浓度为0.8ng/μl。
[0024]优选地，所述的上游引物的浓度为1μmol，下游引物的浓度为1μmol，DNA模板的浓度为0.8ng/μl。
[0025]所述的试剂盒可用于实验室检测、尿液中葡萄球菌属微生物含量异常升高的疾病检测。
[0026]所述试剂盒通过检测待测样本中的葡萄球菌属的微生物评估受检者的膀胱癌患病风险。
[0027]所述待测样本为尿液；优选地，所述尿液来自哺乳动物受检者，例如人类。
[0028]所述的膀胱癌包括非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润膀胱癌，即根据TNM分期的原发肿瘤(T)、区域性淋巴结(N)和远处转移(M)。
[0029]本专利技术的第五方面提供一种检测本专利技术第一方面的标志物的水平的试剂在制备
检测膀胱癌的诊断剂中的应用。当标志物的水平可检测时，该标志物来源的受试者患有膀胱癌的风险较高；当标志物的水平不可测得时，该标志物来源的受试者患有膀胱癌的风险较低。
[0030]本专利技术的第六方面还提供了本专利技术第二方面所述的引物对、第四方面所述的试剂盒在制备检测膀胱癌的诊断剂中的应用。
[0031]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。
[0032]本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0033]本专利技术的积极进步效果在于：
[0034]本专利技术将不同生理状况下微生物组成分的改变作为一种新的用于癌症诊断及预后监测的手段，通过尿液菌群检测实现癌症的检测和监测，无创本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测膀胱癌的标志物，其特征是，所述标志物为包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的一种或多种葡萄球菌属(Staphylococcus)的16S rDNA序列。2.如权利要求1所述的标志物，其特征是，所述的16S rDNA序列为如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。3.一种检测如权利要求1或2所述的标志物的引物对，其特征是，所述的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示；优选地，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:8所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:9所示。4.一种检测膀胱癌的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括如权利要求3所述的引物对。5.如权利要求4所...
【专利技术属性】
技术研发人员：李南南，杨琴，吴逵，罗慧娟，罗甜，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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