葡萄砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了3种葡萄砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用，包括下列步骤：（1）提取叶片基因组DNA；（2）按照简化基因组测序技术Super

【技术实现步骤摘要】
葡萄砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术涉及3种葡萄砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用，属于生物


技术介绍

[0002]葡萄根瘤蚜于19世纪中期从美国东部传到欧洲，在25年内几乎摧毁了法、意、德的葡萄和酿酒业。由于美洲野生种葡萄对根瘤蚜有抵抗能力，1870年Gaston Bazille提出将欧洲葡萄嫁接于美洲葡萄上，由此确定了采用砧木防治根瘤蚜的技术路线，这也是果树栽培史上唯一一个因为一种害虫而需要嫁接栽培的实例。至今，世界葡萄主产区大都采用了抗性砧木嫁接栽培。
[0003]中国对葡萄砧木的探索不以抗线虫和抗根瘤蚜为主要研究方向，其研究重点是抗寒性砧木，其次是抗干旱、盐碱和病虫害等，进入21世纪，在葡萄酒产业和设施栽培特别是避雨栽培的带动下，中国葡萄产业快速扩张，葡萄栽培区域不断向西、向南发展，目前全国葡萄栽培面积达到55.2万hm2，总产量843万吨，但大部分葡萄园为自根系苗建园，使用抗性砧木嫁接苗栽培的比例仍然很低。随着世界性检疫害虫葡萄根瘤蚜在南北方多点的发生，以及中国大陆季风气候带来的冬季寒冷干燥和土壤盐碱等生态逆境的威胁，葡萄嫁接栽培在中国具有广阔的应用潜力，但我国有关于葡萄砧木的研究起步较晚，研究成果较少。
[0004]法国和德国是最早从事葡萄抗性砧木育种的国家，其采用河岸葡萄、沙地葡萄和冬葡萄作为亲本进行杂交。主要有3个杂交组合群体，除了都抗根瘤蚜以外，其耐石灰质、耐旱能力及形成的树势或产量有明显不同。
①
河岸葡萄与沙地葡萄杂交组合。生产上主要使用101
ꢀ‑
14Mgt、3309C两个品种，较抗根癌病，较耐寒，较抗根结线虫能促进嫁接品种早熟，产量低，品质好。
②
河岸葡萄和冬葡萄杂交组合。育成品种有420A、SO4、5BB、5C、8B等，是目前生产上使用最多的类型。耐湿不耐旱，抗根结线虫，抗寒性强，根系较浅，树势中庸偏旺，促进接穗长势，产量中等或偏高。
③
沙地葡萄和冬葡萄杂交组合。育成的砧木也是目前生产上特别是在干旱地区广泛使用的砧木，如99R、110R、140Ru、1103P、1447P、225Ru 等。抗旱，根系分布深，耐瘠薄，嫁接生长势旺，产量高，使接穗品种生长期延长。
[0005]本专利技术开发的葡萄砧木鉴定品种主要是河岸葡萄与沙地葡萄典型后代101
‑
14、河岸葡萄和冬葡萄杂交典型后代5BB及沙地葡萄和冬葡萄典型后代1103P，这3个品种也是目前应用最多的品种，通过本专利技术能够准确鉴定3种常用葡萄砧木，为葡萄砧木的精准生产提供技术支持。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种3种葡萄砧木的特异性分子标记的筛选方法，并应用该方法筛选到5842 个品种特异的SNP标记，基于这些标记开发出两种简便、快速、可靠鉴定3种葡萄砧木的方法，为从源头上准确控制葡萄品种奠定技术基础。
[0007]本专利技术采用下述技术方案予以实现：
[0008]首先，本专利技术提供一种利用简化基因组测序技术Super
‑
GBS筛选3种葡萄砧木的特异性分子标记的方法，包括如下步骤：
[0009](1)利用品种已知且准确的6株1103P、6株5BB和5株101
‑
14葡萄砧木为样品，取叶片提取基因组DNA；
[0010](2)按照简化基因组测序技术Super
‑
GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
[0011](3)对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点；
[0012](4)对SNP进行过滤，过滤条件为：SNP测序深度不低于4；剔除MAF小于0.01的位点；剔除SNP分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点；
[0013](5)根据每个品种的分型结果，筛选每个品种内所有个体分型完全一致、分型一致位点没有个体缺失，且与其他品种不同的位点；最终筛选到5842个SNP位点，具体见表1。
[0014](6)利用5842个SNP位点或者其中的部分SNP位点构建进化树和聚类分析。
[0015]根据表1筛选到5842个SNP位点，能够筛选出几百组准确鉴定3种葡萄砧木品种的SNP 位点标记群，其中三组能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的SNP位点标记群信息及标记扩增引物信息如下如表2
‑
表7：
[0016]表2能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的一组SNP位点信息
[0017]染色体CHROM位置POS1103P5BB101
‑
14NC_012008.380704AAAAGGNC_012008.3116979CCCGCGNC_012008.3117210GGAGGG
[0018]表3所述表2中SNP位点鉴定引物信息
[0019][0020]表4能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的一组SNP位点信息
[0021][0022][0023]表5所述表4中SNP位点鉴定引物信息
[0024][0025]表6能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的一组SNP位点信息
[0026]染色体CHROM位置POS1103P5BB101
‑
14NC_012007.347129TTTTCTNC_012007.3175994ACCCACNC_012007.3343319GTGGGG
[0027]表7所述表6中SNP位点鉴定引物信息
[0028][0029]其次，本专利技术提供一种利用PCR方法鉴定3种葡萄砧木的方法，包括如下步骤：
[0030](1)从表1的SNP位点中筛选几个SNP位点组合成能够鉴定3种葡萄砧木品种的位点群；
[0031](2)根据位点所在的基因组位置设计特异性的PCR扩增引物；
[0032](3)提取3种葡萄砧木基因组DNA；
[0033](4)依据权利要求2所述的SNP标记群筛选方法进行SNP标记位点群筛选，已经筛选出的三个位点群及位点对应的特异性引物，如表2
‑
表7；
[0034](5)利用能够扩增出SNP位点的引物进行PCR扩增；
[0035](6)将获得的PCR产物进行一代测序；
[0036](7)根据测序信息对照SNP位点信息进行葡萄砧木品种的分析和鉴定。
[0037]本专利技术的有益效果：
[0038]本专利技术对3种葡萄砧木的组培苗、嫁接苗、成品苗能够准确的区分，确保种苗繁育企业对品种的把控，减少繁育过程中误差造成的经济损失。
附图说明
[0039]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0040]图1附图为利用筛选到的1103P、5BB和101
‑
14 3种葡萄砧木的5842个特异SNP标记构建进化树，能够准确的区分3种葡萄砧木。
Sciences)，室温静置5min，以去除300bp以下小片段。从上清中回收磁珠，并用200本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.能够准确鉴定3种葡萄砧木包括1103P、5BB和101
‑
14的SNP位点，其特征在于，包括5842个位点，具体位点见表1。2.根据权利要求1所述的SNP位点，其特征在于，能够筛选出几百组准确鉴定3种葡萄砧木品种的SNP位点标记群，其中三组能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的SNP位点标记群信息及标记扩增引物信息如下：表2 能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的一组SNP位点信息染色体CHROM位置POS1103P5BB101
‑
14NC_012008.380704AAAAGGNC_012008.3116979CCCGCGNC_012008.3117210GGAGGG表3 所述表2中SNP位点鉴定引物信息表4 能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的一组SNP位点信息染色体CHROM位置POS1103P5BB101
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14NC_012009.338889CTCCCCNC_012009.341444CTCTTTNC_012009.3302576TTATTT表5 所述表4中SNP位点鉴定引物信息表6 能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的一组SNP位点信息能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的一组SNP位点信息表7 所述表6中SNP位点鉴定引物信息
3.利用简化基因组测序技术Super
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GBS筛选葡萄砧木特异分子标记的方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)利用品种准确的3种葡萄砧木品种包括1103P、5BB和101
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14为样品，提取叶片基因组DNA；(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴永兴，谢魏魏，王晓菲，钟醒宇，黄晓毅，
申请(专利权)人：山东大丰园农业有限公司，
类型：发明
国别省市：