一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法、系统与应用技术方案

本发明专利技术提供了一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法，包括：将经打孔的蓝莓果实浸入含有T‑DNA给体载体和TI辅助质粒的根癌农杆菌宿主菌和含有2‑(N‑吗啉)乙磺酸，氯化镁，乙酰丁香酮农杆菌侵染液组成的农杆菌侵染悬液，得混合物；将前述混合物放入压强为0.01‑0.085MPa发真空环境处理3‑15min。其中，T‑DNA给体载体中的RNAi表达盒含有具有表达元件的RNAi载体靶序列，具有表达元件的用于插入RNAi载体靶序列的位点，或者有具有表达元件的用于置换RNAi载体靶序列的DNA片段。前述方法能够有效地抑制蓝莓果实内源基因表达。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法、系统与应用
本专利技术属于植物基因工程领域，涉及一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法、系统与应用，特别涉及一种抑制内源蓝莓ACO1基因表达的方法、系统与应用。
技术介绍
蓝莓(拉丁文：VacciniumSpp，英文：Blueberry)，又名越桔，蓝浆果，属杜鹃花科(Ericaceae)越桔亚科(Vaccinioideae)越桔属(Vacciniodeae)植物。蓝莓营养丰富，不仅富含常规营养成分，而且还含有极为丰富的黄酮类与多糖类化合物。蓝莓果实含有防止脑神经衰老、增强心脏功能、明目及抗癌等功效物质。而通过抑制蓝莓成熟相关基因的表达，实现蓝莓的晚熟，从而避开蓝莓大批量成熟，对于蓝莓的贮存及采摘都有一系列产业价值。果实成熟、衰老及品质形成是一个复杂的过程，是由遗传和环境等多种因素共同作用的结果，其中激素调节是调控果实成熟与品质的重要因素之一。乙烯作为植物五大激素之一，是具有复杂生物学功能的一种结构简单的有机分子，它影响着高等植物的生长和发育，包括促进果实成熟、花衰老、花瓣和叶片的脱落、抑制绝大多数双子叶植物茎的延长、刺激根的发生等等。同时乙烯在植物应答生物和非生物胁迫的响应中也起到重要的作用，包括病原体入侵、浸水、冷害和机械伤害等等。高等植物中乙烯的生物合成途径已经由Yarg和Hoffman得到证实，第一步由1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)催化s-腺苷甲硫氨酸(SAM)转变为ACC，接着ACC经ACC氧化酶(ACO)氧化形成乙烯，乙烯参与植物生长和发育，因此，ACO基因是乙烯合成的关键基因。瞬时转染是将DNA导入真核细胞的方式之一。在瞬时转染中，重组DNA导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时且高水平的表达。目前果实中常用的瞬时表达方法为注射法，但该方法多适用于番茄、草莓等果肉较为柔软的果实中。由于蓝莓果实细胞结合太过紧密，果实的结构、特性与以往研究的果实不同，用于普通果实的瞬时表达方法不适用于蓝莓果实，因此针头注射的方法不可行。由于农杆菌只有在特定诱导因子存在时才能侵染植物组织伤口处的细胞，而这些研究中均直接使用注射方式进行侵染，侵染效率严重受限。后续的研究工作对在蓝莓果实中的瞬时转染效率有较高的要求，因此一种高效的蓝莓果实瞬时转染方法需求非常迫切。
技术实现思路
本专利技术具体涉及一种基于真空渗入的蓝莓果实瞬时表达以便抑制蓝莓果实内源基因的方法。该方法包括用含有RNAi表达原件的T-DNA给体载体的农杆菌侵染液悬浮活化后的农杆菌；将蓝莓果实用牙签头扎孔；将蓝莓果实置于农杆菌侵染液中，抽真空处理促进农杆菌对植物组织的渗入；将农杆菌侵染后的蓝莓果实暗培养的步骤。本专利技术结合果实预处理和真空处理实现农杆菌渗入蓝莓果实中从而实现农杆菌高效浸染蓝莓果实细胞，并且可以实现高效率的外源基因瞬时表达来抑制内源基因。为了解决现有技术中农杆菌侵染蓝莓果实以便抑制蓝莓果实内源基因效率较低等问题，本专利技术第一方面提供了一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法，所述方法包括如下步骤：S1：将蓝莓果实表面打孔，得到经打孔的蓝莓果实；S2：将所述经打孔的蓝莓果实浸入农杆菌侵染悬液，得到蓝莓果实侵染悬液混合物；所述农杆菌侵染悬液包括重组农杆菌和农杆菌侵染液；所述重组农杆菌为含有T-DNA给体载体和TI辅助质粒的根癌农杆菌宿主菌；所述T-DNA给体载体含有RNAi表达盒，所述RNAi表达盒中含有具有表达元件的RNAi载体靶序列，具有表达元件的用于插入RNAi载体靶序列的位点，或者有具有表达元件的用于置换RNAi载体靶序列的DNA片段；所述农杆菌侵染液中含有2-(N-吗啉)乙磺酸，氯化镁，乙酰丁香酮；S3：将所述蓝莓果实侵染悬液混合物放入真空环境，得到经真空处理的蓝莓果实，所述真空环境的压强为0.01-0.085MPa，处理时间为3-15min。在一些实施方式中，所述RNAi表达盒为瞬时基因表达。在一些实施方式中，在步骤S1中，所述蓝莓果实选自大绿期的蓝莓果实。在一些实施方式中，在步骤S1中，打孔的深度为4-5mm。在一些实施方式中，在步骤S1中，打孔的内径为1-2mm。在一些实施方式中，在步骤S1中，一枚蓝莓果实打孔的个数为3-10。在一些实施方式中，在步骤S1中，一枚蓝莓果实打孔的不同孔之间间距为5-15mm。在一些实施方式中，在步骤S1中，使用无菌针状物或无菌杆状物进行所述打孔。在一些实施方式中，在步骤S2中，将所述T-DNA给体载体和所述Ti辅助质粒同时或相继转化所述根癌农杆菌宿主菌，形成所述重组农杆菌。在一些实施方式中，在步骤S2中，将所述T-DNA给体载体转化含有所述Ti辅助质粒的所述根癌农杆菌宿主菌，形成所述重组农杆菌。在一些实施方式中，在步骤S2中，采用Gateway克隆方法，将所述RNAi载体靶序列重组到所述T-DNA给体载体。在一些实施方式中，在步骤S2中，所述含有所述Ti辅助质粒的所述根癌农杆菌宿主菌为根癌农杆菌GV3101或根癌农杆菌EHA105。在一些实施方式中，在步骤S2中，所述T-DNA给体载体中，所述RNAi载体靶序列的启动子为NOS启动子、MAS启动子或CaMV35S启动子。在一些实施方式中，在步骤S2中，所述T-DNA给体载体中，所述RNAi载体靶序列的终止子为NOS终止子。在一些实施方式中，在步骤S2中，所述T-DNA给体载体为双元表达载体。在一些实施方式中，在步骤S2中，所述T-DNA给体载体为双元表达载体pCAMBIA-1300或双元表达载体GatewayTM277载体。在一些实施方式中，在步骤S2中，所述农杆菌侵染液的组成成分为：8-12mMMgCl2，150-250μM乙酰丁香酮，8-12mM2-(N-吗啉)乙磺酸，水溶液，pH5.0-6.0。在一些实施方式中，在步骤S2中，所述农杆菌侵染液用孔径为0.02μm的滤头过滤除菌后使用。在一些实施方式中，在步骤S2中，所述重组农杆菌的增殖培养基为含有抗生素的LB液体培养基。在一些实施方式中，在步骤S2中，所述重组农杆菌的增殖培养基为含有30-80mg/l利福平和50-150mg/l卡那霉素的LB液体培养基。在一些实施方式中，在步骤S2中，所述重组农杆菌的增殖培养到使用浓度为OD600＝0.5-1.0。在一些实施方式中，在步骤S2中，农杆菌侵染悬液的制备步骤为：将所述重组农杆菌的培养物离心，去除上清，得到第一沉淀；用所述农杆菌侵染液清洗第一沉淀，离心，去除上清，得到第二沉淀；将所述第二沉淀用所述农杆菌侵染液重悬，得到所述农杆菌侵染悬液。在一些实施方式中，在步骤S2中，每次离心的条件为：4000-8000rpm下离心3-10min。在一些实施方式中，在步骤S2中，所述农杆菌侵染液经活化后使用，活化的步骤为：用LB液体培养基培养所述重组农杆菌至菌液OD6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法，所述方法包括如下步骤：/nS1：将蓝莓果实表面打孔，得到经打孔的蓝莓果实；/nS2：将所述经打孔的蓝莓果实浸入农杆菌侵染悬液，得到蓝莓果实侵染悬液混合物；/n所述农杆菌侵染悬液包括重组农杆菌和农杆菌侵染液；/n所述重组农杆菌为含有T-DNA给体载体和TI辅助质粒的根癌农杆菌宿主菌；/n所述T-DNA给体载体含有RNAi表达盒，所述RNAi表达盒中含有具有表达元件的RNAi载体靶序列，具有表达元件的用于插入RNAi载体靶序列的位点，或者有具有表达元件的用于置换RNAi载体靶序列的DNA片段；/n所述农杆菌侵染液中含有2-(N-吗啉)乙磺酸，氯化镁，乙酰丁香酮；/nS3：将所述蓝莓果实侵染悬液混合物放入真空环境，得到经真空处理的蓝莓果实，所述真空环境的压强为0.01-0.085MPa，处理时间为3-15min。/n

【技术特征摘要】
1.一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法，所述方法包括如下步骤：
S1：将蓝莓果实表面打孔，得到经打孔的蓝莓果实；
S2：将所述经打孔的蓝莓果实浸入农杆菌侵染悬液，得到蓝莓果实侵染悬液混合物；
所述农杆菌侵染悬液包括重组农杆菌和农杆菌侵染液；
所述重组农杆菌为含有T-DNA给体载体和TI辅助质粒的根癌农杆菌宿主菌；
所述T-DNA给体载体含有RNAi表达盒，所述RNAi表达盒中含有具有表达元件的RNAi载体靶序列，具有表达元件的用于插入RNAi载体靶序列的位点，或者有具有表达元件的用于置换RNAi载体靶序列的DNA片段；
所述农杆菌侵染液中含有2-(N-吗啉)乙磺酸，氯化镁，乙酰丁香酮；
S3：将所述蓝莓果实侵染悬液混合物放入真空环境，得到经真空处理的蓝莓果实，所述真空环境的压强为0.01-0.085MPa，处理时间为3-15min。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNAi表达盒为瞬时基因表达；
优选地，在步骤S1中，所述蓝莓果实选自大绿期的蓝莓果实；
优选地，在步骤S1中，打孔的深度为4-5mm；
优选地，在步骤S1中，打孔的内径为1-2mm；
优选地，在步骤S1中，一枚蓝莓果实打孔的个数为3-10；
优选地，在步骤S1中，一枚蓝莓果实打孔的不同孔之间间距为5-15mm；
优选地，在步骤S1中，使用无菌针状物或无菌杆状物进行所述打孔。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，将所述T-DNA给体载体和所述Ti辅助质粒同时或相继转化所述根癌农杆菌宿主菌，形成所述重组农杆菌；
优选地，在步骤S2中，将所述T-DNA给体载体转化含有所述Ti辅助质粒的所述根癌农杆菌宿主菌，形成所述重组农杆菌；
优选地，在步骤S2中，采用Gateway克隆方法，将所述RNAi载体靶序列重组到所述T-DNA给体载体；
优选地，在步骤S2中，所述含有所述Ti辅助质粒的所述根癌农杆菌宿主菌为根癌农杆菌GV3101或根癌农杆菌EHA105；
优选地，在步骤S2中，所述T-DNA给体载体中，所述RNAi载体靶序列的启动子为NOS启动子、MAS启动子或CaMV35S启动子；
优选地，在步骤S2中，所述T-DNA给体载体中，所述RNAi载体靶序列的终止子为NOS终止子；
优选地，在步骤S2中，所述T-DNA给体载体为双元表达载体；
优选地，在步骤S2中，所述T-DNA给体载体为双元表达载体pCAMBIA-1300或双元表达载体GatewayTM277载体；
优选地，在步骤S2中，所述农杆菌侵染液的组成成分为：8-12mMMgCl2，150-250μM乙酰丁香酮，8-12mM2-(N-吗啉)乙磺酸，水溶液，pH5.0-6.0；
优选地，在步骤S2中，所述农杆菌侵染液用孔径为0.02μm的滤头过滤除菌后使用；
优选地，在步骤S2中，所述重组农杆菌的增殖培养基为含有抗生素的LB液体培养基；
优选地，在步骤S2中，所述重组农杆菌的增殖培养基为含有30-80mg/l利福平和50-150mg/l卡那霉素的LB液体培养基；
优选地，在步骤S2中，所述重组农杆菌的增殖培养到使用浓度为OD600＝0.5-1.0；
优选地，在步骤S2中，农杆菌侵染悬液的制备步骤为：
将所述重组农杆菌的培养物离心，去除上清，得到第一沉淀；
用所述农杆菌侵染液清洗第一沉淀，离心，去除上清，得到第二沉淀；
将所述第二沉淀用所述农杆菌侵染液重悬，得到所述农杆菌侵染悬液；
优选地，在步骤S2中，每次离心的条件为：4000-8000rpm下离心3-10min；
优选地，在步骤S2中，所述农杆菌侵染液经活化后使用，活化的步骤为：用LB液体培养基培养所述重组农杆菌至菌液OD600＝0.5-1.0；
优选地，在步骤S2中，所述RNAi载体靶序列针对蓝莓ACO1基因；
优选地，所述蓝莓ACO1基因编码的蛋白序列如SEQIDNO.6所示；
优选地，所述蓝莓ACO1基因的编码序列如SEQIDNO.5所示；
优选地，针对所述蓝莓ACO1基因的如...

【专利技术属性】
技术研发人员：周扬颜，莫翱玮，陈文秀，孙卫健，许鹏昊，郭鹏，
申请(专利权)人：山东大丰园农业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37