土贝母苷甲的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种土贝母苷甲的制备方法及应用，所述应用具体指包含该皂苷的疫苗，以及该疫苗在用于预防或治疗传染性疾病中的应用。该方法制备土贝母苷甲，是以土贝母为原料，以乙醇提取，提取液回收乙醇，浓缩，上大孔吸附树脂柱去杂，再经柱色谱或HPLC色谱分离，得到土贝母苷甲。制备方法工艺简单、操作简便，产品收率和纯度高，避免使用氯仿、乙腈、甲醇等第一、二类有机溶剂，无有害溶剂残留，安全性好、生产成本低。制备的产品可以作为疫苗的免疫佐剂，发挥理想的免疫效果。发挥理想的免疫效果。发挥理想的免疫效果。

【技术实现步骤摘要】
土贝母苷甲的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种土贝母苷甲的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]土贝母是葫芦科植物土贝母Bolbostemma paniculatum(Maxim.)Franquet)的干燥块茎，是一味传统中药，最早记载于清代《本草纲目拾遗》。土贝母性味苦，微寒，归肺、脾经，具有解毒，散结，消肿之功效，主治用于乳痈，瘪痂，痰核。土贝母含皂苷类、黄酮类、蒽醌类、甾体类以及其他杂环类化合物。其中土贝母苷甲(Tubeimoside I)是土贝母的主要活性成分之一，其分子式为C
63
H
98
O
29
，分子量为1319.43。
[0003]现代药理研究表明：土贝母苷甲可通过多个分子靶点和不同信号通路，抑制肿瘤细胞生长和增殖，诱导肿瘤细胞分化、凋亡及周期阻滞，调节免疫应答，以及抑制血管生成、黏附、侵袭和转移，对一系列人肿瘤如胃癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、卵巢癌、胶质瘤、食道癌、非小细胞肺癌、乳癌、结直肠癌、前列腺癌、红白血病和胶质母细胞瘤具有良好的治疗作用。同时，申请人研究发现：土贝母苷甲对猪口蹄疫灭活疫苗、猪瘟活疫苗等商品兽用疫苗具有显著的佐剂作用。
[0004]土贝母药材中土贝母苷甲含量较高。魏有良等研究结果表明：土贝母中土贝母苷甲含量在1.4％～1.9％[魏有良,杨小梅,徐长根,高海,孙文基.HPLC法测定土贝母中土贝母苷甲含量[J].西北药学杂志,2000；3:107
‑
108]。黄瑾等报道不同产地土贝母中土贝母苷甲含量在1.4％～1.5％[黄瑾,张杰,顾正兵.高效液相色谱法同时测定土贝母中土贝母苷甲、乙和丙的含量[J].中国药业,2016,25(01):58
‑
60.5]。2020版《中国药典》规定土贝母按干燥品计算，含土贝母昔甲(C
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)不得少于1.0％[国家药典委员会.中华人民共和国药典,2020年版(一部),北京:中国医药科技出版社,2020:17]。因此，制备高纯度的土贝母苷甲单体化合物，作为抗肿瘤药物和疫苗佐剂开发具有良好的前景。
[0005]目前，土贝母苷甲的分离制备工艺已有专利技术专利申请[CN201110029127.2和CN201110026200.0]。申请的专利技术专利1(CN201110029127.2)涉及使用氯仿、二氯甲烷、乙腈、甲醇等第一、二类有机溶剂，易导致有机溶剂残留，对人体和动物有危害；同时，需经聚酰胺、Sephadex LH
‑
20色谱和氧化铝等多种柱色谱分离纯化，步骤繁琐。申请的专利技术专利2(CN201110026200.0)同样需用二氯甲烷、乙腈、甲醇等第一、二类有机溶剂，存在溶剂残留的风险，且该专利技术需用硅藻土、活性炭等脱色，步骤繁琐，吸附损失严重，增加了生产成本。本专利技术涉及一种避免使用氯仿、乙腈、甲醇等危害较大的第一、二类有机溶剂，只经大孔吸附树脂去杂和反相硅胶分离，适合工业化生产纯度高、安全性好的土贝母苷甲的制备方法。同时，本专利技术所涉及方法制备的土贝母苷甲显示出比现有技术中已知的铝胶佐剂不仅能诱导机体对口蹄疫灭活疫苗和猪瘟活疫苗等商品兽用疫苗产生更强体液免疫反应，而且诱生机体产生细胞免疫反应以及Th1型和Th2型免疫应答，可以作为多种兽用疫苗的免疫佐剂，发挥理想的免疫效果。
146S：口蹄疫病毒粒子(FMDV 146S)；Alum：铝胶；TBM I：土贝母苷甲；
a
P<0.05,
b
P<0.01和
c
P<0.001vs FMDV 146S对照组。
[0027]图6为土贝母苷甲对猪瘟活疫苗免疫小鼠刺激原和抗原刺激脾细胞增殖反应的影响。CSFV：猪瘟活疫苗(脾源)；CSFV E2：猪瘟病毒E2蛋白；Quil A：皂苷佐剂阳性药物；TBM I：土贝母苷甲；
b
P<0.01和
c
P<0.001vs CSFV对照组。
具体实施方式
[0028]以下通过实例进一步说明本专利技术，而非限制其范围。
[0029]以下百分比浓度均指质量百分比浓度。
[0030]实施例1：土贝母苷甲制备
[0031]药材土贝母粗粉1kg，以70％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，提取液滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩得醇提取物。醇提取物经D101大孔吸附树脂柱，用水和乙醇混合液进行梯度洗脱，用薄层色谱检查洗脱液，合并具有相同斑点的流份，浓缩至干，得到土贝母苷甲粗品。称取土贝母苷甲粗品2.0g，加50％乙醇5mL溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，滤液注入制备型高效液相色谱仪，流动相为无水乙醇
‑
水(43:57)，流速为8mL/min，收集土贝母苷甲对应色谱峰流出液，减压回收溶剂至干，得透明状土贝母苷甲晶1.02g。
[0032]实施例2：土贝母苷甲纯度检测
[0033]采用高效液相色谱法(HPLC)对制备所得土贝母苷甲的纯度进行检测。色谱条件：色谱柱，Dikmond C18(4.6mm
×
250mm，粒径5μm)；流动相为乙腈
‑
水，乙腈比例变化如下：0
‑
15min，30％
→
35％，15
‑
30min，35％
→
50％，30
‑
35min，50％
→
30％；柱温：35℃；流速，1.0mL/min；DAD检测器；进样量，10μL。采用面积归一法计算，上述制备所得土贝母苷甲的纯度为98.3％(图1)。
[0034]实施例3：土贝母苷甲的高分辨质谱分析
[0035]采用OrbitrapElite质谱仪(Thermo Scientific,Bremen,Germany)检测制备得到的土贝母苷甲的分子量。土贝母苷甲的高分辨电喷雾质谱(HR
‑
ESI
‑
MS)谱图见图2。HR
‑
ESI
‑
MS的准分子离子峰m/z 1317.6167[M
‑
H]‑
(计算值：1318.6174)，分子式：C
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。
[0036]实施例4：土贝母苷甲的核磁共振分析
[0037]采用Angilent DD2
‑
600型核磁共振仪(TMS作内标，DMSO
‑
D6作溶剂)，检测制备得到的土贝母苷甲的氢谱(1H
‑
NMR)和碳谱(
13
C
‑
NMR)。土贝母苷甲的核磁共振氢谱(1H
‑
NMR)和碳谱(
13
C NMR)见图3、4。芳香区δ5.37ppm(1H，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种土贝母苷甲的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：a.土贝母药材粉碎，以乙醇提取；b.提取液减压回收乙醇、浓缩，得到醇提取物；c.醇提取物上大孔吸附树脂柱，以水和乙醇混合液进行梯度洗脱；d.硅胶薄层色谱检查，具有相同斑点的洗脱液合并，浓缩，干燥，得土贝母苷甲粗品；e.土贝母苷甲粗品经柱色谱或HPLC，以洗脱剂洗脱，得到土贝母苷甲。2.根据权利要求1所述的土贝母苷甲的制备方法，其特征在于，所述步骤a采用加热回流提取、超声提取、微波提取、渗漉提取中的一种，提取1
‑
3次。3.根据权利要求1所述的土贝母苷甲的制备方法，其特征在于，所述步骤b中醇提取物的密度为1.05
‑
1.35g/mL。4.根据权利要求1所述的土贝母苷甲的制备方法，其特征在于，所述步骤c采用的大孔吸附树脂为D101、ADS21、DS401或ZTC
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：孙红祥，金俊杰，何燕飞，韩子怡，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：