一种基于双功能多肽修饰过继性长效T细胞模型构建方法及应用技术

本发明专利技术提供一种基于双功能多肽修饰过继性长效T细胞模型构建方法及应用，涉及生物技术领域。所述双功能多肽具有免疫刺激作用和穿膜效应的DP7以脂质插件DSPE

【技术实现步骤摘要】
一种基于双功能多肽修饰过继性长效T细胞模型构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为一种基于双功能多肽修饰过继性长效T细胞模型构建方法及应用。

技术介绍

[0002]过继性T细胞转移(ACT)疗法是通过激活、修复、改构、甚至重建患者抗肿瘤T细胞反应进行肿瘤治疗的方法，天然具有精准治疗的特征。近年来，ACT疗法在肿瘤治疗中的应用取得令人瞩目的进展，例如，嵌合抗原受体T细胞(CAR
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T)疗法在血液系统肿瘤治疗中取得巨大进展。
[0003]另一种基因编辑过继性T细胞治疗技术是TCR
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T技术，这种方法是通过基因编辑的方法引入具有对肿瘤抗原特异性识别能力的TCR，从而增强T细胞对癌细胞的免疫效应。不同T细胞所携带的TCR受体具有多样性，为实施针对不同肿瘤变异信息的精准医学治疗提供了足够的广度。而且，免疫细胞来源于患者自体，作为一种“活的药物”，具有自主性与自我适应能力，能有效缩短开发时间。TCR
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T也有望成为肿瘤精准医疗的一个重要突破口。
[0004]然而，尽管ACT在一些非实体瘤的治疗中取得了进展，但对大部分实体瘤的治疗仍面临诸多问题，难以发挥疗效，其中最主要的就包括T细胞回输体内后持续发挥免疫作用的时间短就是其中的影响其疗效的主要挑战之一。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于双功能多肽修饰过继性长效T细胞模型构建方法及应用解决了T细胞体内持续作用时间短的问题。
[0007](二)技术方案
[0008]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种基于双功能多肽修饰过继性长效T细胞模型构建方法及应用，包括如下步骤：1.构建DSPE
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PEG
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DP7修饰的T细胞；2.考察DSPE
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PEG
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DP7双功能多肽增强T细胞浸润能力和长效作用；3.建立体外产生NY
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ESO
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1特异性CTL的模型；4.建立对NY
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ESO
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1表位特异性的过继性T细胞治疗人卵巢癌小鼠模型。
[0009]优选的，所述双功能多肽具有免疫刺激作用和穿膜双重效应的DP7以脂质插件DSPE
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PEG
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DP7的形式修饰T细胞，经修饰的T细胞模型具有增强的浸润能力和更长的免疫持续时间。
[0010]优选的，所述考察DSPE
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PEG
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DP7双功能多肽增强T细胞浸润能力和免疫效应作用具体体现为：用DSPE
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PEG
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DP7对CD8+T细胞进行修饰，通过体内体外实验对其浸润能力、免疫效应进行考察，包括体外实验：通过(1)浸润能力考察，包括跨血管内皮迁移试验，细胞粘附试验，肿瘤浸润实验；(2)免疫应答实验，包括T细胞增殖试验，CD134/CD137表达，CD107α脱颗粒试验，ELISA检测TNF
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α、IL
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2表达，ELISPOT检测IFN
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γ的表达试验；(3)T细胞长效考
察，包括干性相关基因TCF7,Bcl
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2等的qPCR检测，CD62L,CCR7，CXCR5的流式检测,细胞氨基酸代谢，糖代谢，以及能量代谢的检测。体内试验：在建立的表达NY
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ESO
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1的HLA
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A02阳性乳腺癌小鼠模型中，尾静脉注射回输NY
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ESO
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1特异性CTL细胞，考察肿瘤生长率和负荷率；肿瘤中T细胞的分布特征，取外周血流式检测其中回输细胞的比例。
[0011]优选的，所述跨血管内皮迁移试验为：从C57BL/6小鼠脾脏分离淋巴细胞，或健康人志愿者外周血分离PBMC,纯化得到CD8+T细胞，用DSPE
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PEG
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DP7对分离得到的细胞进行处理，同时将HUVEC接种在预先Matrigel胶涂布的transwell小室的聚碳酸酯膜上，培养形成血管内皮单层，在上室加入处理后的T细胞，下室加入含趋化因子的培养基，24h后计数迁移到下室的细胞。
[0012]所述细胞粘附试验为：Matrigel胶包被96孔板，0.5％BSA封闭2h降低非特异性结合，待进行粘附试验的T细胞用BCECF
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AM或Calcein
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AM染色后，悬浮于PBS或HHMC缓冲液中，以5
×
104/50ul的浓度加入每孔中，37℃作用30min，快速冲洗一次去除未粘附的细胞，以荧光定量粘附的细胞量；
[0013]所述肿瘤浸润实验为：建立小鼠乳腺癌模型，比较分析经DSPE
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PEG
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DP7体外处理的NY
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ESO
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1特异性CD8+T细胞回输后在肿瘤的分布情况。
[0014]优选的，所述体外产生NY
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ESO
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1特异性CTL的模型建立具体体现为：从人外周血分离得到PBMC，其中的贴壁细胞用于诱导DC细胞，悬浮细胞经磁珠纯化分理处CD8+T细胞，用诱导成熟并负载NY
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ESO
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1多肽的DC细胞与CD8+T细胞按1:5混合，DC的再刺激频率为每周一次，每再刺激后5天后检测T细胞用T2细胞作为抗原负载细胞检测其抗原特异性免疫反应，最终获得NY
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ESO
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1抗原特异性的CTL细胞。
[0015]优选的，所述对NY
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ESO
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1表位特异性的过继性T细胞治疗人卵巢癌小鼠模型建立涉及一种稳定表达HLA
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A02(基因ID:3105)的NY
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ESO
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1阳性卵巢癌细胞系。所述的细胞系由重组表达载体pCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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Puro
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HLA
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A02编码HLA
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A02转化。
[0016]所述新型基因修饰增强型NY
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ESO
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1特异型TCR
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T应用于实体瘤治疗，优选的，是对卵巢癌的治疗。
[0017](三)有益效果
[0018]本专利技术提供一种基于双功能多肽修饰过继性长效T细胞模型构建方法及应用。具备以下有益效果：
[0019]1、本专利技术提供一种基于双功能多肽修饰过继性长效T细胞模型构建方法及应用，涉及生物
所述双功能多肽具有免疫刺激作用和穿膜效应的DP7以脂质插件DSPE
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于双功能多肽修饰过继性长效T细胞模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1.构建DSPE
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PEG
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DP7修饰的T细胞；2.考察DSPE
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PEG
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DP7双功能多肽增强T细胞浸润能力和长效作用；3.建立体外产生NY
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ESO
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1特异性CTL的模型；4.建立对NY
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ESO
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1表位特异性的过继性T细胞治疗人卵巢癌小鼠模型；考察DSPE
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PEG
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DP7双功能多肽增强T细胞浸润能力和长效免疫效应作用具体体现为：用DSPE
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PEG
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DP7对CD8+T细胞进行修饰，通过体内体外实验对其浸润能力、免疫效应进行考察，包括体外实验：(1)DSPE
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PEG
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DP7增强T细胞免疫应答的研究，通过(1)浸润能力考察，包括跨血管内皮迁移试验，细胞粘附试验；(2)免疫应答实验，包括T细胞增殖试验，CD134/CD137表达，CD107α脱颗粒试验，ELISA检测TNF
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α、IL
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2表达，ELISPOT检测IFN
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γ的表达试验；(3)T细胞长效考察，包括干性相关基因TCF7,Bcl
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2等的qPCR检测，CD62L,CCR7，CXCR5的流式检测,细胞氨基酸代谢，糖代谢，以及能量代谢的检测。2.根据权利要求1所述的一种基于双功能多肽修饰过继性长效T细胞模型构建方法，其特征在于，DC的体外诱导：取细胞样品，1500rpm离心10min，取上清，56℃水浴35min后2500rpm
×
10min离心，得到灭活血浆，细胞沉淀加入生理盐水至体积120ml，取4支50mlBD管分别加入15ml淋巴细胞分离液，然后吸取细胞混悬液，沿管壁轻轻加入BD管中，每管30ml；细胞2000rpm
×
20min离心(升速3，降速1)，细胞用50ml培养液洗三遍(1500rpm
×
15min,1500rpm
×
5min,1000rpm
×
5min)后，40ml培养液重悬细胞，计数，放入细胞培养箱培养2小时，2小时后，吸去上清，并用生理盐水轻轻洗去未贴壁的细胞，收集悬浮细胞用于淋巴细胞培养，重新加入DC细胞培养液(AIM
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VMediumCST+1％自体灭活血清+1000U/mlrHuGM
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CSF+500U/mlrHuIL
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4)，37℃,5％CO2继续培养；每隔一天给细胞换液，上清中的细胞1000rpm
×
5min离心后重新接种回去继续培养，第五天，加入NY
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ESO
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1多肽40ug/ml刺激；第六天，刺激DC成熟，刺激因子组合如下：rHuTNF
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ɑ
1000U/ml，IFN
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γ2000U/ml，rHuIL
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1β10ng/ml，PGE2250ng/ml，R8481ug/ml，Poly(I：C)20ng/ml；第七天，用手轻拍培养瓶，用吸管吹打方瓶底部，使得成熟DC脱离，然后把细胞液装入50mlBD管中，1000rpm
×
5min离心，离心后的细胞用50ml培养液重悬后，过100um细胞筛网，取样计数。3.根据权利要求1所述的一种基于双功能多肽修饰过继性长效T细胞模型构建方法，其特征在于，NY
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ESO
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1特异性CTL的诱导方法包括：将复苏的CD8+T细胞调整为1X106/ml与2X105负载NY
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ESO
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1多肽的DC混合培养于AIMV培养基(10％血清+4ug/mlβ2微球蛋白)中，第2天添加IL
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2(5IU/ml)和IL
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7(5ng/ml)，第5天半换液并补充IL
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2和IL
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7，每7天加入新的负载NY
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ESO
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1多肽的DC进行再刺激，DC与T细胞比例保持为1:5；每次再刺激5天后对T细胞的特异性进行检测，用负载NY
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ESO
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1多肽的T2作为刺激细胞检测CT...

【专利技术属性】
技术研发人员：易伶潞，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：