一种体外高效扩增NK细胞的培养基及培养方法技术

本发明专利技术公开提供了一种体外高效扩增NK细胞的培养基和培养方法，所述培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为X

【技术实现步骤摘要】
一种体外高效扩增NK细胞的培养基及培养方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，涉及一种体外高效扩增NK细胞的培养基及培养方法。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞（nature killer cell，NK）是独立于T、B细胞的第三类淋巴细胞亚群，是机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节功能，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞是机体先天获得性免疫系统最重要的组成细胞之一，无需预先致敏就可以杀伤某些血液肿瘤和异质细胞群，可在免疫应答早期发挥作用；同时NK细胞可释放穿孔素、颗粒酶B，穿孔素在靶细胞表面穿孔，使颗粒酶B进入靶细胞诱导凋亡程序，同时并分泌大量细胞因子作用于靶细胞，并可表达诱导细胞凋亡的蛋白和肿瘤坏死因子相关诱导配体，使靶细胞发生程序性凋亡。因此，NK细胞在免疫治疗中发挥重要作用。
[0003]目前，NK细胞体外培养方法主要包括：（1）免疫磁珠分选法。从外周血单个核细胞中分离少量NK细胞，经IL-2，IL-12，IL-15，IL-18等细胞因子组合，刺激外周血中单核细胞，获得纯度高，扩增力强，细胞毒性强的NK细胞。（2）NK细胞分离试剂盒法，通过商品化试剂盒进行NK细胞体外扩增。（3）采用照射致死的K562细胞或HFWT细胞刺激PBMC中的NK细胞扩增。然而免疫磁珠分离方法，生产成本较高，费时费力，不利于大规模生产；以肿瘤细胞作为饲养层细胞扩增NK细胞，操作复杂且异体细胞的安全性尚待探讨。虽然商品化培养基可体外扩增NK细胞，但是细胞的纯度和数量并不能满足临床需求。因此，开发一种高效、安全的NK细胞培养基及培养方法是NK细胞的临床研究与应用领域亟待解决的问题之一。

技术实现思路

[0004]本专利技术主要解决的技术问题是提供一种体外高效扩增NK细胞培养基及培养方法，可扩增出稳定增殖，活性高，对肿瘤细胞杀伤力强的NK细胞。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种体外高效扩增NK细胞的培养基，包括基础培养基和添加物，添加物及各组分浓度为：2.0-10.0%自体血浆，0.5-2.0 uM白藜芦醇，1.0-10.0 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1% 非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
[0006]其中，基础培养基为X-VIVO 15培养基。
[0007]其中，添加物各组分及浓度：2.0-10.0%自体血浆，0.5-2.0 uM白藜芦醇，1.0-10.0 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
[0008]其中，添加物各组分及浓度为：10%自体血浆，1 uM白藜芦醇，5 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种体外扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：（1）培养瓶抗体包被：用PBS稀释anti-HER2 MAb至所需浓度，包被T-75细胞培养瓶，4℃
过夜或37℃ 1 h；（2）血液分离：采集外周血50 ml于肝素锂抗凝的采血管中，1000 g离心15 min，取上层血浆，56℃灭活30 min，放置室温，400 g离心20 min分装，4℃保存；（3）单个核细胞分离：Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS洗两遍，细胞计数，调整细胞密度为3-5
×
106个/ml；（4）NK细胞体外诱导培养：细胞培养瓶中加入10%自体血浆，200 U/ml 重组人IL-2，1 ng/ml重组人 IL-15，将细胞培养瓶置于37℃、5% CO2培养箱中培养3到4天。培养预定天数后，获得扩增的NK细胞。其中，NK细胞培养基包括基础培养基和添加物，添加物及各组分浓度为2.0-10.0%自体血浆，0.5-2.0 uM白藜芦醇，1.0-10.0 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1% 非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
[0010]其中，初始悬于NK细胞培养基中NK细胞的密度为5
×
106个/20ml。
[0011]其中，anti-HER2 MAb浓度为10 ug/ml，重组人IL-2浓度为200 IU/ml，重组人IL-15浓度为1 ng/ml。
[0012]其中，基础培养基为X-VIVO 15。
[0013]其中，添加物及各组分浓度为10% 自体血浆，1 uM白藜芦醇，5 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
[0014]其中，细胞培养为细胞培养瓶和透气细胞培养袋。
[0015]本专利技术的有益效果是：通过上述技术方案，本专利技术提供的NK细胞体外扩增培养基能够避免动物血清成分和异体细胞的添加，增加NK细胞在临床应用中的安全性。采用不同组分的培养基在细胞生产的特定阶段有针对性的进行培养，可更好的满足NK细胞在不同阶段的生长需求，更有效的扩增和活化NK细胞，且不改变细胞的表型并能增强细胞的杀伤活力。因此，可以将白藜芦醇，烟酰胺，丙酮酸钠，非必需氨基酸，L-谷氨酰胺添加到培养基中开发成细胞体外专用培养基。通过上述培养基体外扩增NK细胞，可扩增出数量大、活性高、杀伤性强的NK细胞。
附图说明
[0016]图1为实施例中分离培养的NK传代细胞的显微镜图（40
×
）；图2为实施例中分离培养的NK传代细胞的显微镜图（20
×
）；图3为实施例中分离培养的NK传代细胞的显微镜图（10
×
）；图4增殖曲线；图5杀伤活性曲线。
具体实施方式
[0017]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0018]一、实验材料淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；X-VIVO 15，重组人IL-2，重组人IL-15
均购自北京同立海源生物科技有限公司；FITC-Anti-CD3，PE-Anti-CD56，APC-Anti-CD16；FITC Mouse IgG1，κ Isotype Control；PE Mouse IgG1，κ Isotype Control；APCMouse IgG1，κ Isotype Control均购自美国BD公司；CCK-8东仁化学科技（上海）有限公司；烟酰胺，白藜芦醇购自山东优科生物科技有限公司，纯度≥95%。
[0019]二、实验方法1.NK细胞的培养和表型鉴定取健康成年志愿者外周静脉血，肝素锂抗凝后加入淋巴细胞分离液，1000 g离心15 min，取上层血浆，56 ℃灭活30 min，放置室温，400 g离心20 min，分装，备用。将剩余血用PBS 1:1稀释，充分混匀，加入等体积的淋巴细胞分离液，1000 g离心30 min。吸取单个核细胞层。PBS洗涤3次，加入含有10%人自体血浆，1 uM白藜芦醇，5 mM烟酰胺，1%本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外高效扩增NK细胞的培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加物，所述添加物各组分及浓度为：2.0-10.0%自体血浆，0.5-2.0 uM白藜芦醇，1.0-10.0 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。2.根据权利要求1所述的NK细胞的培养基，其特征在于，所述基础培养基为X-VIVO 15培养基。3.根据权利要求1所述的NK细胞的培养基，其特征在于，所述添加物及各组分浓度：2.0%-10.0%自体血浆，0.5-2.0 uM白藜芦醇，1.0-10.0 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1% 非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。4.根据权利要求1所述的NK细胞培养基，其特征在于，所述添加物各组分及浓度为：10%自体血浆，1 uM白藜芦醇，5 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。5.一种体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：培养瓶包被：1 mg/ml anti-HER2 MAb，用无菌7.6~8.2的无菌PBS梯度稀释抗体至所需浓度，包被T-75瓶，4 ℃过夜或37 ℃预包被1 h，最优浓度为10 ug/ml；外周血采集：检测HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体，检测项目均为阴性；单个核细胞分离；接种：细胞以1~5
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【专利技术属性】
技术研发人员：张晓娟，孙海星，林思妮，王建辉，白玉杰，张艳，吴东颖，董红宇，
申请(专利权)人：山东荆卫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：