用于产生引入了CAR基因的NK细胞的方法及其用途技术

本发明专利技术涉及用于产生引入了编码CAR的嵌合抗原受体(CAR)基因的诱导天然杀伤(iNK)细胞的方法，通过该方法产生的iNK细胞，以及包含该iNK细胞的用于预防或治疗癌症的细胞治疗组合物和药物组合物。本发明专利技术的方法具有这样的效果，在不限制初始细胞的情况下，通过直接重新编程从分离的细胞高效产生引入了CAR基因的iNK细胞，并且直接产生iNK细胞而不需要分化过程，从而简化了产生过程，降低了成本和时间。本发明专利技术的方法具有这样的效果，不经过通过常规重编程技术产生的诱导的多能干细胞，通过从易于获得的人体细胞直接产生NK细胞来产生具有增强安全性的优异NK细胞。此外，通过该方法产生的引入了CAR基因的iNK细胞具有优异的癌细胞杀伤能力，因此可以有效地用作预防或治疗癌症的细胞治疗组合物或药物组合物。的细胞治疗组合物或药物组合物。的细胞治疗组合物或药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生引入了CAR基因的NK细胞的方法及其用途


[0001]本专利技术涉及用于产生引入了编码CAR的嵌合抗原受体(CAR)基因的诱导的天然杀伤(induced natural killer(iNK))细胞的方法，通过该方法产生的iNK细胞，以及包含该iNK细胞的用于预防或治疗癌症的细胞治疗组合物和药物组合物。

技术介绍

[0002]NK(天然杀伤)细胞是关键的先天免疫细胞，它通过立即识别和消除病毒、细菌和寄生虫感染以及异常自体细胞(尤其是癌细胞)来执行身体的初级防御(先天免疫)功能。与通过表达抗原特异性受体来识别靶细胞的T细胞不同，NK细胞感知靶细胞(尤其是癌细胞)的异常变化而无需抗原特异性和人白细胞抗原(HLA)匹配，并具有接触依赖性细胞毒性，所述靶细胞(尤其是癌细胞)的异常变化例如抑制或激活受体的平衡，即杀伤性免疫球蛋白受体(KIR)、天然细胞毒性受体(NCR)、DNAM
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1(DNAX辅助分子
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1)和NKG2D(NK组2成员D)，表面MHC(主要组织相容性复合体)I类抗原缺失。
[0003]具体地，NK细胞通过分泌细胞因子，如穿孔素(Prf1)、粒酶B(GzmB)、干扰素
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γ(IFN
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γ)、白细胞介素(肿瘤坏死因子
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α；TNF
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α)等，以及激活凋亡诱导受体(Fas，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；TRAIL)，直接介导靶癌细胞凋亡，可以杀伤癌细胞。此外，已知表达Fc受体FcRγIIIa(CD16)的NK细胞可通过诱导获得性免疫(如介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC))以及先天性免疫直接或间接地有效消除癌细胞。尤其是，与T细胞不同，NK细胞不引起如移植物抗宿主病(GVHD)的副作用，因此作为一种安全的细胞来源而受到关注，不仅可用于自体抗癌免疫细胞治疗，也可用于同种异体抗癌免疫细胞治疗的开发。
[0004]目前，人NK细胞是通过原代培养方法分离和增殖存在于人体[外周血、骨髓、脐带血等]中的少量细胞产生的，或者可以通过分化诱导培养从具有分化为NK细胞能力的干细胞[造血干细胞(HSC))、胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)]多维度获得。
[0005]最近，已经证明，通过引入癌细胞靶嵌合抗原受体(CAR)基因产生的T细胞(CAR
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T细胞)作为促进靶癌细胞特异性和激活从而提高抗癌治疗功效的方法，在血癌治疗中具有增强的抗癌作用，因此在CAR免疫细胞治疗的开发中受到了广泛关注。然而，由CAR
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T细胞分泌的干扰素(IFN)
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γ、肿瘤坏死因子(TNF)
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α、白细胞介素(IL)
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1和IL
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6因子诱导的细胞因子释放综合征(CRS)被认为是一个需要解决的严重问题。此外，已知在实体肿瘤的肿瘤微环境(TME)中，CAR
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T细胞通过免疫检查点蛋白PD(程序性死亡配体)
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1等抑制癌细胞细胞毒性，因此，需要进行技术开发来提高实体瘤治疗的功效。
[0006]然而，由于NK细胞分泌IL
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3和粒细胞
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巨噬细胞集落刺激因子，它们不太可能引起CRS[K.Rezvani,R.Rouce,E.Liu等,Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy,Mol.Ther.,25(2017),1769
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1781页]。此外，NK细胞分泌的PD
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1水平相当低，几乎没有诱导免疫抑制，而且众所周知，NK细胞能够使树突状细胞迁移到肿瘤中，从而增强抗PD
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1免疫治疗[K.C.Barry,J.Hsu,M.L.Broz等A Natural Killer
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dendritic Cell Axis Defines Checkpoint Therapy
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responsive Tumor Microenvironments,Nat.Med.,
24(2018),1178
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1191页]，因此证明了CAR
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NK开发的优越性。此外，CAR
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NK细胞治疗的临床前和临床试验结果确认，NK细胞可有效清除血癌和实体癌细胞[E.L.Siegler,Y.Zhu,P.Wang等Off
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the
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shelf CAR
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NK Cells for Cancer Immunotherapy,Cell Stem Cell,23(2018),160
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161页]，因此被认为有潜力在广泛范围内开发为抗癌免疫细胞治疗，包括用于实体癌。
[0007]作为产生CAR
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NK细胞的方法，主要使用将癌症抗原特异性CAR基因引入相对容易培养和增殖的单个NK细胞系(NK
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92、iPSC等)并分离和扩增表达CAR的NK细胞的方法。最常用的原代培养的NK
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92细胞是来源于恶性非霍奇金淋巴瘤患者，且注射后有潜力诱发继发性肿瘤发生和EB(Epstein
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Barr)病毒敏感性。因此，为了确保安全性，临床应用前必须进行致死性照射过程，但这一过程缩短了CAR
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NK
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92细胞的体内存活时间，从而降低了抗癌效果。通过将CAR基因引入诱导的多能干细胞(IPSC)并诱导分化来产生NK细胞的方法，本质上不仅需要CAR
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iPSC过程以及分离和扩增过程，而且需要复杂的分化过程，需要花费大量时间和成本，并具有肿瘤形成的可能性，因此，开发一种可以确保和维持安全性的技术至关重要。
[0008]最近，一种直接产生高附加值功能性人体组织特异性靶细胞的技术正在迅速发展，该靶细胞具有与初始人类体细胞不同的谱系特征，相对容易用体细胞重编程技术获得。然而，目前还没有关于通过体细胞重编程不经过iPSC直接产生CAR
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NK细胞的技术的报道。
[0009]专利技术概述
[0010]技术问题
[0011]本专利技术人已进行了广泛的努力来开发用于高效产生CAR
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NK细胞的方法，因此，他们开发了CAR
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NK细胞特异性重编程培养基和重编程培养条件，并确认，在不限制初始细胞资源的情况下，可以通过不需要分化过程的方法从人类体细胞产生CAR
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NK细胞，因此，所产生的NKT细胞显示优异的癌细胞杀伤能力，因此可用于癌症的预防或治疗，从而完成本专利技术。
[0012]技术解决方案
[0013]本专利技术的一个目的是提供用于产生CAR
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iNK(诱导的天然杀伤)细胞的方法，其包括：依次在a)含有生长因子、细胞因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于产生CAR
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iNK(诱导的天然杀伤)细胞的方法，其包括：依次在a)含有生长因子、细胞因子和GSK3β(糖原合酶激酶3β)抑制剂的第一培养基；b)含有生长因子、细胞因子和AHR(芳香烃受体)拮抗剂的第二培养基；和c)含有细胞因子、GSK3β抑制剂和AHR拮抗剂的第三培养基中培养引入了重编程因子和CAR(嵌合抗原受体)基因的分离的细胞，从而直接重编程为NK细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中在引入重编程因子时，于选自在a)的第一培养基中培养、b)的第二培养基中培养或c)的第三培养基中培养的任意一个期间将CAR基因引入分离的细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中生长因子是选自SCF(干细胞因子)、FLT3(FMS样酪氨酸激酶)和其组合的任意一种或多种。4.根据权利要求1所述的方法，其中细胞因子是选自IL(白细胞介素)
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3、IL
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6、IL
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15、IL
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7、IL
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2、IL
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21、IL
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12、IL
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18和其组合的任意一种或多种。5.根据权利要求1所述的方法，其中a)的第一培养基包含SCF、FLT3、IL
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3、IL
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6和CHIR99021。6.根据权利要求1所述的方法，其中b)的第二培养基包含SCF、FLT3、IL
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15、IL
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7、IL
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2和StemRegenin I。7.根据权利要求1所述的方法，其中c)的第三培养基包含IL
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2、IL
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15、IL
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21、IL
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12、IL
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18、CHIR99021和StemRegenin I。8.根据权利要求1所述的方法，其中a)的第一培养基、b)的第二培养基或c)的第三培养基进一步包含选自FBS(胎牛血清)、抗生素和其组合的任意一种或多种。9.根据权利要求1所述的方法，其中引入了重编程因子和CAR基因的分离的细胞在a)的第一培养基中培养4至7天，在b)的第二培养基中培养10至14天，然后在c)的第三培养基中培养14天或更长时间。10.根据权利要求1所述的方法，其中重编程因子是选自Lin28、Asc11、Pitx3、Nurr1、Lmx1a、Nanog、Oct4、Oct3、Sox2、Klf4、Myc和其组合的任意一种或多种。11.根据权利要求10所述的方法，其中重编程因子是Oct4、Sox2、K...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵二淑，金汉燮，金在允，B，
申请(专利权)人：韩国生命工学研究院，
类型：发明
国别省市：