使用CAS9/RNP和AAV病毒的组合来产生用于癌症免疫疗法的嵌合抗原受体（CAR）-原代NK细胞制造技术

公开了使用CRISPR/CAS9系统的腺相关病毒(AAV)递送和用于整合的核糖核蛋白对细胞进行遗传工程改造的方法。在一些方面中，本文公开了用于进行该方法的AAV质粒。了用于进行该方法的AAV质粒。了用于进行该方法的AAV质粒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞，包括但不限于原代或扩增细胞)进行遗传修饰的方法，该方法包括：a)获得核糖核蛋白 (RNP)复合物和AAV载体，该复合物包含与相应的CRISPR/Cas向导RNA复合的2 类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)，该AAV载体包含质粒，该质粒包含转基因(诸如例如，用于肿瘤抗原的嵌合抗原受体)，其中该转基因侧接同源性臂，并且其中该同源性臂的长度为800bp或更短；和b)将转基因和RNP复合物引入到细胞中，其中通过将腺相关病毒(AAV)感染到细胞中而将转基因引入到细胞中，其中该RNP复合物与该细胞的基因组DNA内的靶序列杂交，并且该细胞的DNA修复酶将该转基因插入到该靶序列处的宿主基因组中(例如，通过同源修复)，从而产生修饰的细胞。在一些方面中，可以通过电穿孔将RNP复合物引入到细胞中。在一些方面中，可以在相同或不同的AAV 中通过病毒递送(即，双重感染)将RNP复合物引入到细胞中。
[0013]在一个方面中，本文公开了通过非同源末端连接对细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞，包括但不限于原代或扩增细胞)进行遗传修饰的方法，该方法包括a)获得核糖核蛋白 (RNP)复合物和AAV载体，该复合物包含与相应的CRISPR/Cas向导RNA复合的2 类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)，该AAV载体包含质粒，该质粒包含转基因(诸如例如，用于肿瘤抗原的嵌合抗原受体)，其中该转基因与一个PAM和crRNA相邻或侧接两个PAM和crRNA；和b)将转基因和RNP复合物引入到细胞中，其中该转基因通过用腺相关病毒(AAV)感染到靶细胞中而被引入到该细胞中，其中核糖核蛋白(RNP) 复合物与细胞的基因组DNA内的切割靶序列杂交，并且细胞的DNA修复酶将转基因插入到靶序列处的宿主基因组中(例如通过非同源末端连接)，从而产生修饰的细胞。
[0014]本文还公开了对任何前述方面的细胞进行遗传修饰的方法，其中在感染和/或电穿孔之前，在IL
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2和/或经辐照的饲养细胞的存在下将原代细胞孵育4天。
[0015]本文还公开了对任何前述方面的细胞进行遗传修饰的方法，进一步包括在感染和/或电穿孔之后，用经辐照的表达mbIL
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21的饲养细胞扩增修饰的细胞。
附图说明
[0016]并入本说明书并构成本说明书一部分的附图示出了几个实施例，并与描述一起示出了所公开的组合物和方法。
[0017]图1示出了使用AAV载体用于递送CRISPR/Cas9和转基因的CRISPR/Cas 9复合物的示意图。该示意图详细说明了CRISPR/Cas9系统在通过同源性定向修复整合转基因中的作用，示出了染色体19上的AAVS1靶位点，并提供了同源性臂为30、300、500或 800bp的供体质粒的详情。
[0018]图2示出了含CRISPR/Cas9的质粒的示意图。
[0019]图3A和3B示出了用于非同源末端连接方法的转基因的质粒的示意图，诸如HITI 或CRISPaint(在本文中被称为质粒9和10(3B))，其具有单个PAM+crRNA，以及质粒11和12(3A)，其添加了第二PAM+crRNA。应当注意，该图示出了gRNA，据了解 gRNA包含PAM和crRNA。
[0020]图4A和4B示出了用于转染NK细胞的AAV血清型的测定。图4A示出了在不同转染条件下各种AAV血清型的GFP的表达。图4B示出了NK细胞中AAV 6基因组DNA 的拷贝数。
[0021]图5A、5B和5C示出了使用PCR评估mCherry报告基因整合到HEK293细胞的 AAVS1基
因座中(5A)。示出了用于扩增mCherry1(正向引物为SEQ ID NO:2，反向引物为SE QID NO:3)和mCherry2(正向引物为SEQ ID NO:4，反向引物为SE QID NO: 5)的正向引物和反向引物。此外，使用流式细胞术(5B)和荧光显微镜检查(5C)研究了mCherry的稳定基因表达。*这些结果代表了12个设计的AAV构建体中的2个。所使用的gRNA：GGGGCCACTAGGGACAGGAT(SEQ ID NO:1)。
[0022]图6A和6B示出了使用PCR(6A)评估mCherry报告基因整合到人原代NK细胞的AAVS1基因座中。使用流式细胞术(6B)研究了mCherry扩增后的稳定基因表达。*这些结果代表了12个设计的AAV构建体中的2个。
[0023]图7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G和7H示出了包含质粒1、2、3、4、5、6、7和 8的mCherry转基因的示意图，显示左同源性臂(LHA)、剪接受体、转基因、多聚腺苷酸化终止子和右同源性臂(RHA)的相对位置；以及整个构建体的相应序列。图7A 和7B示出了30bp同源性臂质粒1和2的示意图和序列(SEQ ID NO:13)。图7C和7D 示出了300bp同源性臂质粒3和4的示意图和序列(SEQ ID NO:14)。图7E和7F示出了500bp同源性臂质粒5和6的示意图和序列(SEQ ID NO:15)。图7G和7H示出了包含800bp LHA和1000bp RHA的800bp同源性臂质粒7和8的示意图和序列(SEQ IDNO:16)。
[0024]图8示出了NK分离和扩增的方案。从健康供体的血沉棕黄层中分离出原代人NK 细胞，并且使用mbIL21 K562扩增7天。
[0025]图9示出了分离的NK细胞的流式细胞术结果，显示NK细胞的纯度。通过CD3和 CD56的染色评估从血沉棕黄层分离的细胞的T细胞污染。根据流式细胞术结果，分离的淋巴细胞＞90％CD3
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阴性，CD56
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阳性。
[0026]图10示出了ATAC
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seq分析显示NK细胞中的AAVS1具有合适的基因插入的染色质可及性(chromatin accessibility)。ATAC
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序列峰代表开放染色质区域。数据显示，在原始和扩增第7天的NK细胞中，AAVS1具有相似的染色质可及性。
[0027]图11示出了靶向人原代NK细胞中目的基因的Cas9/RNP的产生和电穿孔。为了制作gRNA，将预转录的crRNA和示踪RNA在95℃下退火5分钟。然后在室温下将预翻译的Cas9核酸内切酶蛋白与gRNA混合10分钟。将Cas9/RNP和电穿孔增强剂添加到 NK细胞中。然后将混合物转移至Lonza4D核感染比色皿中。使用Lonza 4D采用EN
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138 程序对细胞进行电穿孔。
[0028]图12示出了ICE分析，显示使用Cas9/RNP在NK细胞中成功的基因(AAVS1)靶向。ICE使用桑格测序数据对CRISPR编辑进行定量分析。使用这种方法，我们发现超过85％的NK细胞成功靶向AAVS1基因座。
[0029]图1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关的9(Cas9)整合系统的质粒，其中所述质粒依次包括左同源性臂、剪接受体、转基因和右同源性臂，其中所述左同源性臂和右同源性臂的长度各自为800bp或更短。2.根据权利要求1所述的质粒，进一步包括在所述转基因与所述右同源性臂之间的聚腺苷酸化信号。3.根据权利要求1或2所述的质粒，其中所述左同源性臂和所述右同源性臂的长度相同。4.根据权利要求3所述的质粒，其中所述同源性臂的长度为30bp。5.根据权利要求3所述的质粒，其中所述同源性臂的长度为300bp。6.根据权利要求3所述的质粒，其中所述同源性臂的长度为500bp。7.根据权利要求3所述的质粒，其中所述同源性臂的长度为800bp。8.根据权利要求1或2所述的质粒，其中所述左同源性臂和所述右同源性臂的长度不同。9.一种用于CRISPR/Cas9整合方法的质粒，由1或2个前间区序列邻近基序(PAM)和CRISPR RNA(crRNA)以及转基因组成，其中编码的核酸的顺序包括PAM、crRNA和转基因，并且其中当使用2个PAM和crRNA时，所述编码的核酸的顺序包括第一PAM、第一crRNA、转基因、第二PAM和第二gRNA。10.根据权利要求1至9中任一项所述的质粒，其中根据权利要求1至8中任一项所述的质粒的所述同源性臂和根据权利要求9所述的质粒的PAM与人的染色体19的腺相关病毒整合位点1(AAVS1)特异性杂交。11.根据权利要求1至10中任一项所述的质粒，其中所述转基因包含编码用于肿瘤抗原的嵌合抗原受体的多核苷酸。12.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的质粒。13.根据权利要求12所述的AAV载体，其中所述AAV的血清型包括AAV6。14.根据权利要求12或13所述的AAV载体，其中所述载体进一步包含编码crRNA、示踪RNA(trcrRNA)和CAS核酸内切酶的质粒。15.根据权利要求12至14中任一项所述的AAV载体，其中所述载体是单链AAV(ssAAV)。16.根据权利要求12至15中任一项所述的AAV载体，其中所述载体是自互补AAV(scAAV)。17.一种修饰的细胞，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的质粒或根据权利要求12至16中任一项所述的AAV载体。18.根据权利要求17所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是CAR NK细胞。19.一种治疗受试者的癌症的方法，包括向患有癌症的受试者施用根据权利要求17或18所述的修饰的细胞。20.一种通过同源定向修复对细胞进行遗传修饰的方法，包括a)获得核糖核蛋白(RNP)复合物和AAV载体，所述RNP复合物包含与相应的CRISPR/Cas向导RNA复合的2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)，所述AAV载体包含有包含转基因(诸如例如，用于肿瘤抗原的嵌合抗原受体)的质粒，其中所述转基因侧接同源性臂，并且其中所述同源性臂的长度为800bp或更短；和
b)将所述转基因和所述RNP...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：全国儿童医院研究所，
类型：发明
国别省市：