一种红千层内生真菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，特别涉及一种红千层内生真菌及其应用，所述红千层内生真菌分类命名为：Neofusicoccum sp.J019，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，其保藏编号为：GDMCC 61810，保藏日期为：2021年7月16日。本发明专利技术获得的红千层内生真菌Neofusicoccum sp.J019在PD液体培养基中获得的发酵产物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌有较强抑制作用，对肠沙门氏菌有很强抑制作用。本发明专利技术为生产抗菌药物提供新的资源和途径。药物提供新的资源和途径。药物提供新的资源和途径。

【技术实现步骤摘要】
一种红千层内生真菌及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，特别涉及一种红千层内生真菌及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，细菌耐药性持续增强，国际临床抗生素用药仍不乏一些老产品，如头孢菌素类、喹诺酮类、大环内酯类以及青霉素类药物等。早在1958年，美国开发出糖肽类抗生素万古霉素，在多个国家广泛应用于临床，十年后华北制药厂成功研制去甲万古霉素，在临床上对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌导致的肺部感染有良好疗效，被作为万古霉素仿制药使用。但由于抗生素的滥用，抗菌药物的持续研发仍迫在眉睫，并且需要深入探索环境友好型、可人工再生的优质药源。
[0003]近年来，针对桃金娘科植物代谢物抗虫和抗菌作用的研究是天然药物化学的热点方向，该科植物富含柠檬烯、α
–
蒎烯等活性成分。桃金娘科约有100属，3000余种，其中包括有白千层属、红千层属等。白千层属(Melaleuca)为较好的庭园观赏树，主要分布在大洋洲。白千层属的植物精油对大肠杆菌、粪产碱杆菌、白色念珠菌等多种细菌具有抗菌活性，其中香茅醛和香茅醇共同作用使得柠檬桉精油具有抗菌活性。红千层属(Callistemon)也是广泛用于绿化、园艺观赏、入药和制取精油等。此外，垂枝红千层(C.viminalis)来源精油对人体致病菌枯草芽孢杆菌有显著的抑制作用。桃金娘科植物的化学成分非常丰富，不断有新颖活性天然产物被发掘，一直以来受到天然产物学家的热切关注。
[0004]植物内生菌是具有成药潜力的天然产物的重要来源，与其宿主植物之间的具有共生关系。已有研究显示，植物内生菌的代谢产物不仅可以表现出与宿主植物化学成分活性的差异，还存在产生与宿主植物相同或相似的药用活性成分的情况，比如紫杉醇及其类似物，喜树碱和10
–
羟基喜树碱，石杉碱甲，金丝桃素等。这提示我们桃金娘科植物内生菌中可能存在某些内生真菌，能够产生具有抗菌活性的代谢产物，这将为抗菌药物的开发提供重要资源，有望发现新的活性药物分子和先导化合物。
[0005]目前仅有少量文献报道对桃金娘科红千层属植物红千层(C.rigidus R.Br.)的研究，对红千层内生菌的研究更加匮乏。

技术实现思路

[0006]为了克服上述现有技术中的问题，提供一种红千层内生真菌及其应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]一种红千层内生真菌，所述红千层内生真菌分类命名为：Neofusicoccum sp.J019，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，其保藏编号为：GDMCC 61810，保藏日期为：2021年7月16日，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼。
[0009]所述红千层内生真菌Neofusicoccum sp.J019，提取其基因组DNA，利用ITS通用引物ITS1和ITS4进行扩增分析，得到单一DNA条带，提交GenBank数据库中进行Blast比对，筛选相似度最高的序列，建立系统进化树，最终鉴定为新壳梭孢Neofusicoccum sp.。该菌株
在PD液体培养基中获得的发酵产物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌有较强抑制作用，对肠沙门氏菌有很强抑制作用。
[0010]所述红千层内生真菌的代谢产物的制备方法，包括以下步骤：
[0011]S1.取
‑
80℃，20％甘油保藏的菌种，解冻后吸出甘油水溶液，挑取菌种到PDA平板上，25～30℃恒温活化3～7天；
[0012]S2.将步骤S1活化后的菌种在PDA平板上划线接种，置于25～30℃培养箱生长3～7天后用于大量发酵的接种，每块长满菌体的平板以无菌水刮洗菌体，接种到PD液体培养基中，于28℃恒温振荡培养摇床中以120～150rpm的转数培养7天得到发酵液；
[0013]S3.将步骤S2获得的发酵液进行过滤，滤液用等量乙酸乙酯萃取2～5次，合并乙酸乙酯层并减压浓缩，得到菌株发酵代谢产物。
[0014]所述红千层内生真菌的代谢产物的制备方法所获得的红千层内生真菌的代谢产物。
[0015]所述红千层内生真菌的代谢产物在制备抗菌药物中的应用。
[0016]优选地，所述代谢产物在制备抗肠沙门氏菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌药物中的应用。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有以下技术效果：
[0018]本专利技术公开的一种红千层内生真菌的代谢产物的制备方法，获得的红千层内生真菌Neofusicoccum sp.J019在PD液体培养基中获得的发酵产物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌有较强抑制作用，对肠沙门氏菌有很强抑制作用。本专利技术为生产抗菌药物提供新的资源和途径。
附图说明
[0019]图1五株红千层内生真菌菌落形态，a菌株J014；b菌株J015；c菌株J016；d菌株J019；e菌株J020；
[0020]图2五株红千层内生真菌的系统进化树,1菌株J014；2菌株J015；3菌株J016；4菌株J019；5菌株J020；
[0021]图3菌株J019次级代谢产物的HPLC峰形图，a 208nm；b 254nm。
具体实施方式
[0022]下面对本专利技术的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本专利技术，但并不构成对本专利技术的限定。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0023]本专利技术中涉及到的主要原辅料：
[0024]受试菌株：抑菌实验所用菌株为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ATCC25922、金黄色葡萄球菌金黄亚种(Staphylococcus aureus subsp.aureus)ATCC29213、肠沙门氏菌肠亚种(Salmonella enterica subsp.enterica)ATCC14028、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853，以上菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)。
[0025]头孢他啶购自上海源叶生物科技有限公司；青霉素G钠购自Biosharp公司，DMSO购
自Sigma公司。
[0026]下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0027]实施例1红千层内生真菌的分离
[0028]PDA单抗培养基(每升)：去皮鲜马铃薯200g，切碎，煮沸30min，以8层纱布过滤，加入葡萄糖20g，KH2PO
4 3g，MgSO4
·
7H2O 1.5g，维生素B
1 10mg，琼脂20g，加蒸馏水定容至1L，自然pH，121℃灭菌30min。灭菌后加入40μg/mL硫酸卡那霉素。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种红千层内生真菌，其特征在于，所述红千层内生真菌分类命名为：Neofusicoccum sp.J019，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，其保藏编号为：GDMCC 61810，保藏日期为：2021年7月16日。2.权利要求1所述红千层内生真菌的代谢产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.取
‑
80℃，20％甘油保藏的菌种，解冻后吸出甘油水溶液，挑取菌种到PDA平板上，25～30℃恒温活化3～7天；S2.将步骤S1活化后的菌种在PDA平板上划线接种，置于25～30℃培养箱生长3～7天后用于大量...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛永波，贾舒杰，苏向东，严文思，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：