基于胆囊癌标志物的试剂盒及药物制造技术

本发明专利技术公开了胆囊癌诊断和预后判断标志物PIM1，还公开了胆囊癌诊断和预后判断的试剂盒，其可用于诊断、预测、检测或筛查人胆囊癌细胞扩散、胆囊癌临床分期或胆囊癌患者预后。本发明专利技术还公开了PIM1蛋白抑制剂在制备抗胆囊癌药物中的用途。本发明专利技术表明PIM1在临床实践中有非常重要的意义，有可能成为新一代的肿瘤生物诊断标志物和用于肿瘤治疗的分子靶标，开辟了以PIM1为主的胆囊癌疾病全新靶标的研究，也为研制抗肿瘤新药开辟新的途径。研制抗肿瘤新药开辟新的途径。研制抗肿瘤新药开辟新的途径。

【技术实现步骤摘要】
基于胆囊癌标志物的试剂盒及药物


[0001]本专利技术涉及A61P 35/00


技术介绍

[0002]胆囊癌(gallbladder cancer，简称GBC)是胆道恶性肿瘤最常见的形式，占胆道恶性肿瘤的80％
‑
95％。在过去的几十年中，胆囊癌治疗策略未取得实质性进展，且因缺乏典型症状，早期诊断率仅有19.1％，多数患者明确诊断时已处于中晚期阶段。目前为止，手术切除仍然是胆囊癌患者的主要治疗方法，然而手术切除并不适合晚期患者。胆囊癌对放疗、化疗等治疗措施均不敏感，故整体预后极差，国外流行病学研究表明胆囊癌术后5年生存率仅5％。除此之外，术后易复发或者转移很大程度上决定了晚期胆囊癌的不良预后。据报道，胆囊癌的发生是由复杂的遗传因素及环境因素造成的，然而，胆囊癌进展的分子机制尚不清楚。因此，探究用于确诊胆囊癌的早期检测的生物标志物和有效治疗策略是至关重要的。
[0003]PIM家族，包括PIM1，PIM2和PIM3，，PIM1在胆囊癌中的表达水平和功能作用尚不清楚，这需要更多的研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在解决现有技术中存在的技术问题。
[0005]为了探究胆囊癌中PIM1的表达水平，我们采用了组织芯片技术和免疫组织化学技术，探究胆囊癌组织及邻近的癌旁组织标本中PIM1蛋白表达水平，并通过蛋白印迹技术在胆囊癌组织及胆囊癌细胞中对结果进行进一步验证。在蛋白水平探究PIM1的表达结果显示，胆囊癌中PIM1表达显著高于癌旁组织。
[0006]为进一步探究PIM1的表达和胆囊癌临床特征及预后之间的关系，本专利技术人证实了PIM1在TNM分期为III—IV期的样本中表达水平显著高于I—II期样本；本专利技术人还证实了PIM1在肿瘤发生远处转移的样本中表达水平显著高于肿瘤未发生远处转移的样本，本专利技术证实PIM1分子可以用于制备、预测、筛查人胆囊癌扩散、肿瘤临床分期的试剂盒。
[0007]本专利技术人还进行Kaplan
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Meier生存分析，结果显示PIM1基因高表达组患者生存时间显著短于PIM1基因低表达患者，患病期间PIM1表达的增加与胆囊癌的临床预后存在着密切的相关性。PIM1表达可以作为胆囊癌预后生存时间的参考判断指标及预后生存风险预测参考。
[0008]为了进一步探究PIM1基因在胆囊癌发生发展中的作用，本专利技术人采用PIM1干扰RNA及PIM1特异性抑制剂SGI
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1776，分别抑制PIM1在胆囊癌细胞中的表达，分析对胆囊癌细胞增殖、迁移、侵袭及细胞凋亡的影响，本专利技术人证实抑制PIM1表达，胆囊癌细胞增殖、迁移、侵袭能力显著降低，细胞凋亡显著增加，胆囊癌标志物PIM1还可作为筛选制备诊断、缓解或治疗胆囊癌的药剂的分子靶标。
[0009]本专利技术还应用慢病毒敲除的PIM1的GBC
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SD细胞接种至裸鼠皮下，证实了抑制PIM1表达对胆囊癌细胞体内成瘤能力的影响，本专利技术人发现PIM1敲除的实验组与不进行敲除的
对照组相比，肿瘤体积、荧光表达显著降低，本专利技术再次证明胆囊癌标志物PIM1还可作为筛选制备诊断、缓解或治疗胆囊癌的药剂的分子靶标。第一方面，本专利技术公开了人PIM1蛋白，作为胆囊癌诊断和/或预后判断标志物的用途。
[0010]第二方面，本专利技术公开了人PIM1蛋白用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于胆囊癌诊断和/或预后判断；对应地，本专利技术提供了试剂盒，该试剂盒包含抗人PIM1蛋白的抗体，且用于胆囊癌诊断和/或预后判断；抗体可为单克隆或多克隆抗体。试剂盒可用于诊断、预测、检测或筛查人胆囊癌细胞扩散、胆囊癌临床分期或胆囊癌患者预后。
[0011]第三方面，本专利技术提供了PIM1蛋白抑制剂在制备抗胆囊癌药物中的用途，所述抑制剂为SGI
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1776、其药学上可接受的盐，或PIM1特异性干扰RNA。进一步地，所述药物用于缓解或治疗胆囊癌，或者用于改善胆囊癌患者的预后。
[0012]需注意的是，前面第1
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3任一方面所述的胆囊癌TNM分期可为III—IV期(优选)或I—II期。
[0013]本专利技术表明PIM1在临床实践中有非常重要的意义，有可能成为新一代的肿瘤生物诊断标志物和用于肿瘤治疗的分子靶标；尤其是开辟了以PIM1为主的胆囊癌疾病全新靶标的研究，也为研制抗肿瘤新药开辟新的途径。
附图说明
[0014]图1.1为蛋白印迹图，其中PIM1对应表示胆囊癌组织中PIM1蛋白的表达水平；
[0015]图1.2为蛋白印迹图，其中PIM1对应表示四种胆囊癌细胞系PIM1蛋白的表达水平。
[0016]图2.1表示通过组织芯片技术和免疫组织化学技术对胆囊癌及癌旁组织中PIM1蛋白表达差异进行统计分析，我们发现：PIM1在胆囊癌样本中表达水平显著高于癌旁样本；
[0017]图2.2A为PIM1的表达水平与TNM分期的相关性分析，我们发现：PIM1在TNM分期为III
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IV的胆囊癌样本中表达水平显著高于I
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II的胆囊癌样本；
[0018]图2.2B表示通过组织芯片技术和免疫组织化学技术对PIM1的表达水平与胆囊癌远处转移情况的相关性进行统计分析，我们发现：PIM1在合并转移的胆囊癌样本中表达水平显著高于未合并转移的胆囊癌样本；
[0019]图2.3为PIM1表达水平与患者总体生存率间的相关性分析，Kaplan
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Meier生存分析结果显示PIM1高表达组患者的总生存时间显著短于PIM1低表达组的患者，即PIM1高表达提示更差的临床预后。
[0020]图3.1A为实验3.1GBC
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SD胆囊癌细胞增殖对比图，图3.1B为实验3.1NOZ胆囊癌细胞增殖对比图；图3.2为实验3.2胆囊癌细胞迁移情况对比图；图3.3为实验3.3胆囊癌细胞侵袭情况对比图；各图中实验组为应用干扰RNA抑制PIM1的表达，对照组为未应用干扰RNA的胆囊癌细胞，结果显示：PIM1表达下调后，细胞增殖、迁移、侵袭能力显著减弱。
[0021]图4为PIM1实验组和对照组裸鼠标准化光子通量变化曲线，该实验研究PIM1下调后对裸鼠成瘤能力的影响，结果显示：PIM1敲除的实验组，肿瘤体积显著低于对照组。
具体实施方式
[0022]下面通过几个典型实验解释本专利技术，本专利技术并不限于此。
[0023]一、Western blot检测胆囊癌组织及细胞中PIM1蛋白的表达
[0024]实验1.1：
[0025]将液氮保存的9例胆囊癌组织加入组织蛋白裂解液，用电动匀浆器在冰上进行充分研磨，置于冰上摇床反应1h，4℃10000r/min离心15min后取上清液。利用BCA法酶标仪检测蛋白浓度，并将蛋白调整一致加入缓冲液100℃煮沸5min。分别将蛋白样品加至预制的12％聚丙烯酰胺凝胶泳道，在110V电压下电泳90min。蛋白电泳完成后电转移至硝酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SGI
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1776或其药学上可接受的盐在制备抗胆囊癌药物中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征是，所述抗胆囊癌药物用于缓解或治疗胆囊癌，或者用于改善胆囊癌患者的预后。3.药物组合物，其包含PIM1特异性干扰RNA以及SGI
‑
1776或其药学上可接受的盐。4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征是，所述RNA的正义链序列自5
′
至3
′
为GAUAUGGUGUGUGGAGAUAtt，所述RNA的反义链序列自5
...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛晨，何玉婷，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：