一种类似胞外陷阱的微网结构及其体外制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种类似胞外陷阱的微网结构及其体外制备方法和应用，其中，体外制备方法包括以下步骤：获取菲律宾蛤仔血细胞、提取菲律宾蛤仔血细胞DNA、在树脂上固相合成菲律宾蛤仔防御素多肽、菲律宾蛤仔血细胞DNA与固相防御素以等质量百分比混合并超声15s。本发明专利技术的有益之处在于：本发明专利技术提供的制备方法能够有效形成类似胞外陷阱的微网结构，形成的类似胞外陷阱的微网结构具有抑制细菌生长的功能。胞外陷阱的微网结构具有抑制细菌生长的功能。胞外陷阱的微网结构具有抑制细菌生长的功能。

【技术实现步骤摘要】
一种类似胞外陷阱的微网结构及其体外制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种类似胞外陷阱的微网结构及其体外制备方法和应用，属于细胞生物学


技术介绍

[0002]胞外陷阱（extracellular traps，ETs）是以细胞内核酸为骨架，负载抗菌蛋白和水解酶所组成的纤维网状结构，能够包裹并杀伤外来入侵的病原微生物，是一种不同于凋亡和坏死的新型细胞死亡方式，其所包含的抗菌蛋白包括组蛋白、髓过氧化物酶、钙蛋白、防御素及其他抗菌肽等。自2004年Brinkmann等在嗜中性粒细胞中发现了胞外陷阱现象以来，已在多种生物的不同类型细胞中发现了胞外陷阱的存在。胞外陷阱可阻止病原微生物由入侵位置向周边组织扩散，集中多种抗菌肽而使局部抗菌肽浓度升高，加大对病原微生物的杀灭作用，亦可形成不依赖于杀伤作用的防御系统，捕获入侵微生物并阻止其迁移。然而，胞外陷阱复杂的形成过程使其研究变得困难。因此，利用简单且明确的类似胞外陷阱的生物材料来进行胞外陷阱相关的研究是非常有必要的。
[0003]免疫组织或细胞能够释放抗菌蛋白以抵御外来病原菌的侵袭，而胞外陷阱能够负载抗菌蛋白并浓缩抗菌蛋白的浓度，达到更好的杀菌效果。已有研究成功将人中性粒细胞胞外陷阱结构分离出来，且分离的胞外陷阱结构可成功用于各种实验或功能分析。这使得在没有细胞自身潜在混杂效应的情况下，能够对胞外陷阱的生物学特性进行评估。然而，从细胞中分离出胞外陷阱结构需要重复离心和洗涤，这通常会导致蛋白质的部分损失。因此，体外合成微网结构及微网结构的功能值得进一步的研究。
[0004]已有研究通过将λ噬菌体DNA和组蛋白在HBSS溶液中进行声化学络合，合成具有确定组成成分的胞外陷阱样材料，其在尺寸和结构上与胞外陷阱具有相似性。在组蛋白存在下，λ噬菌体DNA可以自发聚合成网络，这有助于形成网状结构，它以类似于胞外陷阱的方式捕获致病性大肠杆菌。防御素是近年来被广泛关注的抗菌肽，在脊椎动物和无脊椎动物中都被发现。防御素是富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽家族成员，它们可以与带负电荷的细菌或真菌膜发生静电相互作用，随后导致膜破裂或改变代谢过程，最终导致细胞死亡。并且菲律宾蛤仔血细胞胞外陷阱的形成伴随着大量防御素的产生，带负电荷的DNA可以与带正电荷的防御素通过静电作用结合。
[0005]海洋无脊椎动物通常生活在富含微生物的水环境中，经常面临着多种病原微生物的侵袭。作为无脊椎动物群体，海洋贝类缺乏适应性免疫，因此它们进化出复杂的固有免疫策略来抵御病原体。胞外陷阱是固有免疫细胞特有的一种新型免疫方式，在抵御病原微生物入侵方面发挥着重要作用。因此，本专利技术利用菲律宾蛤仔血细胞DNA和抗菌肽制剂在体外模拟胞外陷阱结构，并确定模拟胞外陷阱结构的抑菌功能，进一步为了解菲律宾蛤仔胞外陷阱结构及新型抗菌制剂的普及提供新思路。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于：利用菲律宾蛤仔血细胞DNA和抗菌肽制剂（菲律宾蛤仔防御素多肽），提供一种类似胞外陷阱的微网结构，以及该微网结构的体外制备方法和应用。
[0007]为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种类似胞外陷阱的微网结构的体外制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：获取菲律宾蛤仔血细胞；步骤2：提取菲律宾蛤仔血细胞DNA；步骤3：在树脂上固相合成菲律宾蛤仔防御素多肽，得到固相防御素；步骤4：将步骤2提取的菲律宾蛤仔血细胞DNA和步骤3得到的固相防御素以等质量百分比溶于PBS中，用超声波破碎仪超声15s，获得含有菲律宾蛤仔血细胞DNA和固相防御素的微网结构。
[0008]优选的，在步骤1中，获取菲律宾蛤仔血细胞的方法具体如下：对菲律宾蛤仔进行开壳处理，取血窦处的血细胞，然后将血细胞用4
°
C预冷的离心机400g离心5min，收集血细胞，再使用PBS清洗血细胞两次。
[0009]优选的，在步骤2中，提取菲律宾蛤仔血细胞DNA的方法具体如下：向新鲜的血细胞中加入20μL蛋白激酶K并混匀，然后加入200μL缓冲液GB颠倒混匀，70
°
C反应10min，之后加入200μL无水乙醇振荡混匀15s，接着将混合液加入吸附柱中，13400g离心30s，弃掉废液，向吸附柱中依次加入500μL缓冲液GD、600μL漂洗液进行洗涤，最后用50μL洗脱液洗脱得到菲律宾蛤仔血细胞DNA。
[0010]优选的，在步骤3中，所述树脂选用的是N，N
‑
二甲基甲酰胺，在N，N
‑
二甲基甲酰胺上固相合成菲律宾蛤仔防御素多肽的方法具体如下：将Fmoc保护氨基酸衍生物、N，N
′‑
二异丙基碳二亚胺和1
‑
羟基苯并三唑置于N，N
‑
二甲基甲酰胺中进行偶联，得到带有Fmoc保护的二肽中间体，该二肽中间体再与待缩合的氨基酸衍生物置于N，N
‑
二甲基甲酰胺中进行偶联，重复上述过程，依次缩合氨基酸，直到得到全保护多肽，然后在室温下加入由三氟乙酸、三异丙基硅烷、乙二硫醇和水按照体积比94.0:1.0:2.5:2.5混合而成的混合液进行180min的切割和最终脱保护，肽产物先用二异丙醚沉淀，再用水萃取并冷冻干燥，最后使用C18色谱柱通过HPLC纯化多肽，用含有0.1% 三氟乙酸的乙腈线性梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长220nm。
[0011]本专利技术的有益之处在于：本专利技术提供的制备方法能够有效形成类似胞外陷阱的微网结构，形成的类似胞外陷阱的微网结构具有抑制细菌（鳗弧菌和大肠杆菌）生长的功能。
附图说明
[0012]图1是步骤3得到的产物报告图，其中（A）是产物HPLC图，（B）是产物质谱图；图2是本专利技术制备得到的微网结构的扫描电镜图；图3是固相防御素的质量分数与微网结构的Zeta电位值的关系图；图4是本专利技术制备得到的微网结构对细菌的抑菌作用图，其中（A）是鳗弧菌抑菌作用图，（B）是大肠杆菌抑菌作用图。
具体实施方式
[0013]以下结合附图和具体实施例对本专利技术作具体的介绍。
[0014]一、类似胞外陷阱的微网结构的体外制备方法步骤1、获取菲律宾蛤仔血细胞对菲律宾蛤仔进行开壳处理，取血窦处的血细胞，然后将血细胞用4
°
C预冷的离心机400g离心5min，收集血细胞，再使用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗血细胞两次。
[0015]步骤2、提取菲律宾蛤仔血细胞DNA向新鲜的血细胞中加入20μL蛋白激酶K并混匀，然后加入200μL缓冲液GB颠倒混匀，70
°
C反应10min，之后加入200μL无水乙醇振荡混匀15s，接着将混合液加入吸附柱CB3中，13400g离心30s，弃掉废液，向吸附柱中依次加入500μL缓冲液GD、600μL漂洗液PW进行洗涤，最后用50μL洗脱液TE洗脱得到菲律宾蛤仔血细胞DNA，使用Nanodrop2000检测DNA浓度。
[0016]步骤3、合成菲律宾蛤仔防御素多肽采用Fmoc方法在Rink酰胺树脂上固相合成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种类似胞外陷阱的微网结构的体外制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：获取菲律宾蛤仔血细胞；步骤2：提取菲律宾蛤仔血细胞DNA；步骤3：在树脂上固相合成菲律宾蛤仔防御素多肽，得到固相防御素；步骤4：将步骤2提取的菲律宾蛤仔血细胞DNA和步骤3得到的固相防御素以等质量百分比溶于PBS中，用超声波破碎仪超声15s，获得含有菲律宾蛤仔血细胞DNA和固相防御素的微网结构。2.根据权利要求1所述的类似胞外陷阱的微网结构的体外制备方法，其特征在于，在步骤1中，获取菲律宾蛤仔血细胞的方法具体如下：对菲律宾蛤仔进行开壳处理，取血窦处的血细胞，然后将血细胞用4
°
C预冷的离心机400g离心5min，收集血细胞，再使用PBS清洗血细胞两次。3.根据权利要求1所述的类似胞外陷阱的微网结构的体外制备方法，其特征在于，在步骤2中，提取菲律宾蛤仔血细胞DNA的方法具体如下：向新鲜的血细胞中加入20μL蛋白激酶K并混匀，然后加入200μL缓冲液GB颠倒混匀，70
°
C反应10min，之后加入200μL无水乙醇振荡混匀15s，接着将混合液加入吸附柱中，13400g离心30s，弃掉废液，向吸附柱中依次加入500μL缓冲液GD、600μL漂洗液进行洗涤，最后用50μL洗脱液洗脱得到菲律宾...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨顶珑，吕晓静，韩怡静，陈钰莹，赵建民，
申请(专利权)人：中国科学院烟台海岸带研究所，
类型：发明
国别省市：