一种同型半胱氨酸和维生素B12的检测方法、检测试纸条及其应用技术

本发明专利技术提供一种同型半胱氨酸和维生素B12的检测方法、检测试纸条及其应用，属于分析化学和临床检测技术领域。所述检测方法包括采用竞争法，以固相免疫层析形式进行测定。所述基于量子点的免疫层析试纸条包括底板，所述底板上依次设置有样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，相邻各垫在连接处交叠连接。所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上依次设置检测线1、检测线2和质控线。本发明专利技术通过对同型半胱氨酸和维生素B12的解离和检测过程进行优化，从而实现对上述物质的快速、灵敏和特异性检测。测。测。

【技术实现步骤摘要】
一种同型半胱氨酸和维生素B12的检测方法、检测试纸条及其应用


[0001]本专利技术属于分析化学和临床检测
，具体涉及一种同型半胱氨酸和维生素B12的检测方法、检测试纸条及其应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是一种含巯基的氨基酸，是人体内甲硫氨酸代谢过程中的重要中间代谢产物。研究发现，在疾病条件下，酶的代谢出现障碍，血液中的Hcy浓度升高。Hcy已被国际医学界认为是动脉粥样硬化和血栓、冠心病等心脑血管疾病发病的独立危险因子，其临床意义甚至已被认为超过胆固醇。此外，Hcy升高还是反映人体维生素B12缺乏的一个灵敏的生物标记物。
[0004]维生素B12（Vitamin B12，VB12），是一种含有3价钴的多环系化合物，4个还原的吡咯环连在一起变成为1个咕啉大环（与卟啉相似），是唯一含金属元素的必需水溶性维生素，在机体内的物质代谢过程中发挥重要作用，缺乏时会引起机体出现巨幼红细胞贫血，会诱发各种神经性疾病。因此，具有高选择性和灵敏度的同型半胱氨酸和VB12检测方法具有重要的价值。
[0005]现有针对同型半胱氨酸和VB12检测方法主要包括高效液相色谱
‑
紫外光谱、原子吸收光谱(AAS)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、分光光度法和微生物学分析法等等。但这些检测方法普遍存在检出限高、分析时间长、价格高昂、需要专业技术人员等问题。
[0006]量子点(QDs)作为一种新型的发光纳米材料，其在检测领域具有独特的光致发光，化学稳定性和出色的生物相容性。但目前基于量子点(QDs)的荧光检测体系对前体物质和检测环境要求严格，分析时间长，成本高，无法满足快速大量的检测需要，检测流程复杂；对同型半胱氨酸和VB12特异性不强。同时，同型半胱氨酸和VB12在体内是与蛋白结合而存在的，所以在检测血清或血浆等生物样本时，需要对样本进行解离，使其将同型半胱氨酸和VB12从结合蛋白上释放出来，再进行检测。然而，目前前处理过程往往过于复杂，且解离不彻底，从而导致检测结果并不准确。

技术实现思路

[0007]针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种同型半胱氨酸和维生素B12的检测方法、检测试纸条及其应用。本专利技术通过对同型半胱氨酸和维生素B12的解离和检测过程进行优化，从而实现对上述物质的快速、灵敏和特异性检测。
[0008]本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术的第一个方面，提供一种同型半胱氨酸和维生素B12的检测方法，所述检测
方法包括采用竞争法，以固相免疫层析形式进行测定。
[0009]具体的，当待测物为同型半胱氨酸时，所述检测方法包括：S1、将待测样品加入稀释液中进行稀释并解离，并通过酶促反应使其转化为S
‑
腺苷同型半胱氨酸（SAH）的待测物；S2、将上述待测物加入基于量子点的免疫层析试纸条上，对显色完成的试纸条进行荧光检测。
[0010]其中，所述稀释液包括解离剂R1和转化剂R2，R1与R2按照体积比为7~10:1（优选为9:1）进行混合，其中解离剂R1为含有1~10 mM（优选为5 mM） DTT的Tris
‑
HCl溶液，R2为含有1~10 U/ml（优选为5 U/ml）S
‑
腺苷同型半胱氨酸水解酶的Tris
‑
HCl溶液，催化待测样品向SAH转化。
[0011]具体的，当待测物为维生素B12时，所述检测方法包括：S1、将待测样品加入稀释液中进行稀释并解离，经还原后在氰化物条件下转化为氰钴胺素的待测物；S2、将上述待测物加入基于量子点的免疫层析试纸条上，对显色完成的试纸条进行荧光检测。
[0012]其中，所述稀释液为含有硫代甘油、DTT和氰化钾的强碱溶液；更具体的，所述强碱溶液为0.01~0.1M（优选为0.05M）的NaOH溶液，所述硫代甘油的终浓度为0.5~2 mM，优选为1 mM）；DTT的终浓度为1~10mM，优选为5mM；氰化钾的终浓度为0.001~0.01%，优选为0.005%。
[0013]所述待测样品可以为血液制品，包括但不限于全血、血清和血浆。
[0014]本专利技术的第二个方面，提供一种基于量子点的免疫层析试纸条，所述基于量子点的免疫层析试纸条包括底板，所述底板上依次设置有样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，相邻各垫在连接处交叠连接。
[0015]其中，所述样品垫上喷涂有缓释膜。
[0016]具体的，所述样品垫可由玻璃纤维素膜材质制成，其具有极佳的亲水性，迅速重湿润，使得结合物释放充分。
[0017]所述缓释膜由明胶、羟丙基甲基纤维素（HPMC）和甘油加入水中搅拌均匀后获得，通过调整明胶、HPMC和甘油的配比，以及调整含水量，控制其成膜性，并达到控制其在加入样本液后5min定时溶解的目的，且整个过程对检测结果无影响。
[0018]其中，所述明胶、羟丙基甲基纤维素和甘油的质量比为1~3:1:1，优选为2:1:1，所述明胶和水的质量体积比为1~3g：50ml；优选为2g：50ml；本专利技术的一个具体实施方式中，将2g明胶加入到50ml纯化水中，先浸泡2h，再恒温至65
°
C左右匀速搅拌使其溶解；然后向其中加入1g羟丙基甲基纤维素（HPMC）和1g甘油，充分搅拌混匀后即得。
[0019]具体过程如下：将血液样本与解离剂混合后制成样本液，取一定量的样本液滴加到加样孔处，此处的膜起到了物理隔离的作用，使样本中的待测物质被解离剂充分解离、转化，5min之后，膜被溶解掉，解离后的待测物被释放进入样品垫，随即开始展板。
[0020]所述检测垫以硝酸纤维素膜（NC膜）为基垫，硝酸纤维素膜上依次设置检测线和质控线。
[0021]当待测物为同型半胱氨酸时，
所述结合垫喷涂有量子点标记SAH抗体和量子点标记鸡IgY抗体；进一步的，二者质量比可以为0.5~2:1，优选为1:1。
[0022]其中，所述量子点为CdSe/ZnS量子点，相对普通荧光物质，其具有发射光谱半峰宽小、发光效率高、灵敏度高、性能稳定等优点。
[0023]所述SAH抗体为SAH单克隆抗体；具体的，所述量子点标记SAH抗体采用如下制备方法获得：将CdSe/ZnS量子点加入缓冲液中活化量子点羧基后，将其与所述SAH单克隆抗体的氨基基团连接。
[0024]具体的，所述制备方法包括：将CdSe/ZnS量子点加入MES缓冲液中进行活化，然后向其中加入EDC、NHS，然后再加入SAH单克隆抗体混合充分反应后，使用硼酸盐缓冲液进行离心洗脱，复溶后稀释即得。
[0025]其中，所述MES缓冲液为中性或弱酸性，进一步优选为pH为5~7，如pH为6.5。
[0026]所述硼酸盐缓冲液为中性或弱碱性，进一步优选为pH为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同型半胱氨酸和维生素B12的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括采用竞争法，以固相免疫层析形式进行测定。2.如权利要求1所述同型半胱氨酸和维生素B12的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：当待测物为同型半胱氨酸时，S1、将待测样品加入稀释液中进行稀释并解离，进行加酶使其转化为S
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腺苷同型半胱氨酸的待测物；S2、将上述待测物加入基于量子点的免疫层析试纸条上，对显色完成的试纸条进行荧光检测；所述稀释液包括解离剂R1和转化剂R2；其中解离剂R1含有1~10 mM DTT的Tris
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HCl溶液，R2为含有1~10 U/ml的S
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腺苷同型半胱氨酸水解酶的Tris
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HCl溶液，催化待测样品向SAH转化；其中，R1与R2按照体积比为7~10:1进行混合。3.如权利要求1所述同型半胱氨酸和维生素B12的检测方法，其特征在于，当待测物为维生素B12时，所述检测方法包括：S1、将待测样品加入稀释液中进行稀释并解离，经还原后在氰化物条件下转化为氰钴胺素得待测物；S2、将上述待测物加入基于量子点的免疫层析试纸条上，对显色完成的试纸条进行荧光检测；所述稀释液为含有硫代甘油、DTT和氰化钾的强碱溶液；其中，所述强碱溶液为0.01~0.1M的NaOH溶液，所述硫代甘油的终浓度为0.5~2 mM，；DTT的终浓度为1~10mM；氰化钾的终浓度为0.001~0.01%。4.如权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品为血液制品，所述血液制品包括全血、血清和血浆。5.一种基于量子点的免疫层析试纸条，其特征在于，所述基于量子点的免疫层析试纸条包括底板，所述底板上依次设置有样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，相邻各垫在连接处交叠连接；所述样品垫上喷涂有缓释膜；所述样品垫由玻璃纤维素膜材质制成；所述缓释膜由明胶、羟丙基甲基纤维素和甘油加入水中搅拌均匀后获得；所述明胶、羟丙基甲基纤维素和甘油的质量比为1~3:1:1，所述明胶和水的...

【专利技术属性】
技术研发人员：何长锋，谢煜萍，姚丛丛，王学士，
申请(专利权)人：山东子峰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：