拉萨裸裂尻鱼环境DNA检测的引物和探针及其应用制造技术

本发明专利技术涉及用于拉萨裸裂尻鱼环境DNA检测的引物和探针及其应用方法,属于分子生态学领域。所述引物为：ScYo

【技术实现步骤摘要】
拉萨裸裂尻鱼环境DNA检测的引物和探针及其应用


[0001]本专利技术属于分子生态学领域，具体涉及用于拉萨裸裂尻鱼环境DNA检测的引物和探针及其应用。

技术介绍

[0002]雅鲁藏布江是世界上海拔最高的河流，水系内共有裂腹鱼类4属9种，其中大部分为雅鲁藏布江所特有。拉萨裸裂尻鱼(Schizopygopsis younghusbandi)主要分布于雅鲁藏布江中上游，具有生长缓慢、性成熟晚、繁殖力低等特点，其资源一旦遭到破坏，很难得到恢复。近十几年来，由于水利水电工程建设、过度捕捞、外来物种入侵等影响，拉萨裸裂尻鱼的资源量急剧下降，急需得到有效保护。对其分布及丰度等资源状况的监测可为其资源保护和管理提供科学依据。常用的网捕等监测方法对鱼类种群具有很大伤害，且费时费力、效率低。
[0003]环境DNA(eDNA)是指从水、土壤或沉积物等环境样品中提取的DNA。水体中游离的鱼类DNA可能来源于从鱼类身体上脱落或排出的皮肤、排泄物、精子和卵子等。环境DNA技术通过提取水样DNA，利用物种特异分子标记检测物种分布及丰度，为鱼类物种检测提供了新方法，具有对鱼类种群无损伤、简单高效、灵敏度高等优点。该技术的成功实现取决于检测引物对某鱼类物种具有高效且特异性的扩增。一般情况下，近缘关系较近的同科甚至同属鱼类物种常分布于同一水域，常用的DNA条形码引物难以对其中一个物种进行精确地检测。
[0004]与拉萨裸裂尻鱼同域分布的不仅有尖裸鲤、拉萨裂腹鱼、双须叶须鱼等土著鲤科鱼类，而且有鲤、鲫、麦穗鱼等外来鲤科鱼类。这些物种线粒体基因序列的相似度较高，如果利用常用的鱼类物种鉴定引物来对拉萨裸裂尻鱼进行环境DNA检测，其他近缘物种的非特异性扩增会给结果带来很大影响。因此，需要开发只对拉萨裸裂尻鱼具有高效且特异性扩增的分子标记引物，才能达到精确的环境DNA检测的目的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，针对鱼类物种的环境DNA检测易受同域分布近缘物种的影响等问题，利用分子标记技术，开发一组用于拉萨裸裂尻鱼环境DNA检测的引物和探针，具有最优特异性、灵敏性和扩增效率，即ScYo
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F、ScYo
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R和ScYo
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P。另一个目的在于提供了该引物和探针在检测拉萨裸裂尻鱼分布和丰度中的应用。
[0006]为了解决本专利技术的技术问题，提出的技术方案为：一种用于拉萨裸裂尻鱼环境DNA检测的引物和探针，所述引物序列为：ScYo
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F(SEQ ID NO:1):CTCTGCTCCATACCTCCAAGCT和ScYo
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R(SEQ ID NO:2)：TGAGAAACAGTGCAAAGTACAGGG,所述探针序列为ScYo
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P(SEQ ID NO:3)：ACTAACATTCCGCCCAATCACCC。
[0007]为了解决本专利技术的技术问题，提出的另一技术方案为：所述的引物和探针在检测拉萨裸裂尻鱼分布和丰度中的应用，包括如下步骤：
[0008](1)采集水样和提取eDNA；
[0009](2)利用权利要求1所述的引物和探针对eDNA进行微滴式数字PCR(ddPCR),反应体系为：10.0ul 2
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ddPCR Supermix for Probes、各0.5ul的正反向引物、0.3ul探针、2.0ul DNA模板、6.7ul ddH2O；反应参数为：95℃预变性10min；40个循环：95℃变性30s，56℃退火延伸1min；98℃10min；
[0010](3)采用微滴分析仪读取并分析反应体系中目标DNA片段的拷贝数，计算出拉萨裸裂尻鱼的环境DNA浓度(copy/ml)。
[0011]为了解决本专利技术的技术问题，提出的另一技术方案为：一种用于快速检测拉萨裸裂尻鱼的试剂盒，包含权利要求1所述的引物和探针。
[0012]为了解决本专利技术的技术问题，提出的另一技术方案为：所述的用于快速检测拉萨裸裂尻鱼的试剂盒，还包含ddPCR缓冲液和ddH2O。
[0013]本专利技术的目的是这样实现的：首先获取与拉萨裸裂尻鱼同域分布的潜在鱼类名录，确定可能影响检测效果的近缘物种，然后根据所有物种线粒体序列的比对信息，在种内保守但种间差异大的区域设计引物和探针，通过实验筛选得出只对拉萨裸裂尻鱼具有高效且特异性扩增的最佳引物和探针，再结合ddPCR技术，建立拉萨裸裂尻鱼的环境DNA检测技术。
[0014]1.用于拉萨裸裂尻鱼环境DNA检测的引物和探针
[0015]拉萨裸裂尻鱼主要分布于雅鲁藏布江中上游，申请人通过实地调查和文献查阅收集了该流域分布的鱼类名录和线粒体基因序列。利用ClustalW软件对基因序列进行线性排列,利用Primer5软件根据以下原则设计针对拉萨裸裂尻鱼检测的引物和探针：(1)正反向引物序列与其他任何鱼类相比至少具有两个碱基的差异；(2)正反向引物及探针序列在种内高度保守,没有变异位点；(3)扩增子长度为100
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200bp；(4)其他参照常规引物和探针的设计规则。设计了六组引物和探针，经过大量的实验筛选，选出具有最优特异性、灵敏性和扩增效率的一组，即正反向引物为：ScYo
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F:CTCTGCTCCATACCTCCAAGCT和ScYo
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R：TGAGAAACAGTGCAAAGTACAGGG,探针为ScYo
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P：ACTAACATTCCGCCCAATCACCC，扩增子长度为177bp。利用该引物和探针在各物种中进行PCR扩增，证实其仅适用于拉萨裸裂尻鱼的环境DNA检测。
[0016]2.引物和探针在检测拉萨裸裂尻鱼分布和丰度中的应用
[0017]基于上文引物和探针，结合微滴式数字PCR(ddPCR)技术，建立了拉萨裸裂尻鱼的环境DNA检测方法，主要步骤如下：(1)采集水样和提取eDNA；(2)以ScYo
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F和ScYo
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R为引物，以ScYo
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P为探针，在探针5
’
和3
’
分别标记荧光报告基团和淬灭基团，以水样eDNA为模板进行ddPCR扩增，设置反应参数为：95℃预变性10min；40个循环：95℃变性30s，56℃退火延伸1min；98℃ 10min；(3)扩增完成后放入微滴分析仪中，用QuantaSoft软件读取并分析反应体系中目标DNA的拷贝数；(4)计算水样中拉萨裸裂尻鱼的DNA浓度(copy/ml)。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有下列优点：
[0019](1).环境DNA检测技术为单种鱼类的物种监测提供了新方法，现有的方法是根据物种的DNA序列设计引物和探针，通过qPCR或ddPCR检测物种，忽视了同域分布近缘种的影响。通过现有方法得到的拉萨裸裂尻鱼的引物和探针，虽然扩增效率高，但可能不具特异性，即在没有拉萨裸裂尻鱼分布的水体中依然能检测出它的存在。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于拉萨裸裂尻鱼环境DNA检测的引物和探针，所述引物序列为：ScYo
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F(SEQ ID NO:1):CTCTGCTCCATACCTCCAAGCT和ScYo
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R(SEQ ID NO:2)：TGAGAAACAGTGCAAAGTACAGGG,所述探针序列为ScYo
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P(SEQ ID NO:3)：ACTAACATTCCGCCCAATCACCC。2.根据权利要求1所述的引物和探针在检测拉萨裸裂尻鱼分布和丰度中的应用，其特征在于：包括如下步骤：(1)采集水样和提取eDNA；(2)利用权利要求1所述的引物和探针对eDNA进行微滴式数字PCR(ddPC...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯秀，李冰，隋晓云，贾银涛，朱仁，陈毅峰，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
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