龙胆苦苷衍生物及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了坚龙胆来源的龙胆苦苷的制备方法和以此为基础合成的龙胆苦苷衍生物及其合成方法。本发明专利技术通过PC12细胞生物活性系统的评价发现这些化合物拟神经生长因子活性较好，可在制备抗阿尔茨海默症药物和保健品中应用。本发明专利技术为抗阿尔茨海默症的新药研发和基础性研究提供依据，具有重要的现实意义。具有重要的现实意义。具有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
龙胆苦苷衍生物及其制备和应用


[0001]本专利技术涉及医药
，具体涉及一类龙胆苦苷衍生物及其制备和应用。

技术介绍

[0002]随着现代社会医疗卫生水平的提高，人类平均寿命延长，社会老龄化现象日益严重。相关统计报告预计，至2050年，60岁以上人口将达20亿，约占世界总人口22％。随着老龄化加剧，老年性相关疾病发病率也逐年攀升，阿尔茨海默症(Alzheimer
’
s disease，AD)，俗称老年痴呆症，是发病率最高的疾病之一。相关报告显示，60岁及以上患病老人中11.2％是由老年痴呆症引起，高于中风、心血管疾病和癌症发病人群。因此，对AD的发病机制深入研究，并研发相关药物已经引起科学界的高度关注，对于推动社会科学进步和人类生命健康有重大意义。
[0003]一般而言，AD是一种慢性神经退行性疾病，主要是因为β
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淀粉样蛋白(Aβ)和磷酸化的Tau蛋白在神经系统积聚，导致突触功能障碍，引发认知功能损伤。AD的精确分子机制尚未完全了解，目前科学上存在基于致病因素的各种理论和假设，如Aβ淀粉样肽学说、Tau蛋白异常磷酸化学说、胆碱能系统损伤学说、自由基氧化应激学说、其他疾病如糖尿病或高血压的影响、免疫系统功能障碍和基因突变等。综合所有这些假说可以得出这样的结论：AD是一种多因素疾病。
[0004]目前科学家根据不同的病理机制，现已研究出几大类相应的治疗药物。当今市场上抗AD的一线治疗药，包括乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)，如他克林、卡巴拉汀、加兰他敏、多奈哌齐和我国自主研发并上市的石杉碱甲，已经通过美国FDA认证，目前已广泛投入市场。但这些药物只能在一定程度上缓解病人的早期症状，而无法根治疾病。另外还有一种典型代表药物美金刚(memantine)，主要是通过阻断谷氨酸NMDA受体(N
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methyl
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D
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aspartic acid receptor)，延缓对神经细胞有毒性作用的兴奋性神经递质谷氨酸的释放速度。目前，美金刚是唯一用于中度和重度阶段AD的药物。美金刚的作用机制与AChEI有所不同，二者可以合用，以增加疗效。
[0005]而其他对AD有效的药物，如大脑代谢调节剂吡咯烷酮衍生物吡拉西坦，是促进脑部代谢的代表性药物，或者磷酸二酯酶抑制剂如丙戊茶碱，是一种能舒张血管舒张，促进脑部循环，改善脑能量代谢。相似药物还有吡硫醇和脑活素等。另外，钙拮抗剂尼莫地平对脑循环损伤有一定的保护作用，扩张脑部血管，提高大脑血液循环，从而改善AD患者认知功能障碍。
[0006]另外抗氧化剂和自由基清除剂，可以一定程度上保护神经细胞免受损伤，对AD有一定的治疗作用。实验研究用银杏叶(Ginkgo biloba L.)提取物治疗AD患者，发现其能明显改善神经细胞由于氧化应激损伤造成的患者认知功能障碍。积雪草(Centella asiatica(L.)Urban)提取物白藜芦醇可以缓解痴呆雄性大鼠模型的认知损伤，清除大鼠脑内多余自由基，保护神经系统免受其影响。维生素C和维生素E有良好的抗氧化效果，提高细胞膜的稳定性，保护中枢神经系统的海马区细胞，还能抑制和清除脑内沉积的Aβ，改善AD症状。
[0007]神经生长因子(NGF)由中枢神经系统前额叶脑组织产生，经胆碱能神经元摄取后运输到胞体，是维持机体神经元的生长和分化最有效的成分，同时对于神经元损伤的修复和再生效果显著。实验研究探讨NGF对老年痴呆鼠学习记忆能力的影响，通过Morris水迷宫实验和Y迷宫测试发现NGF对中枢胆碱能神经元有营养作用，能提高中枢神经系统突触间隙ACh的释放，激活AChE的活性，能有效防止神经元变性和死亡，改善AD鼠认知功能障碍，逆转痴呆症状，提高学习记忆能力。但由于NGF极性高，难以透过血脑屏障，限制了它在治疗AD中的应用。因此，寻找具有拟NGF的具有促神经元再生活性的，容易通过血脑屏障的小分子化合物，具有较高的研究价值和广泛的应用前景。
[0008]天然产物作为大自然经过漫长的筛选和进化选择出来的结果，其结构与功能研究对新药发现、生命科学的认识、探索药物作用机制具有重要科学意义。从天然产物中开发可作为药物先导化合物、具有生物活性的小分子，为药物研发提供了新的思路。在抗AD药物开发领域，目前科学已发现天然产物中的有效成分如萜类、酯类、生物碱、糖苷类甾体化合物等具有显著的神经保护功能方面的药理活性。
[0009]坚龙胆为龙胆科植物，多年生草本，分布于广西、四川、贵州、云南等地。已有研究表明坚龙胆具有抗氧化、抗炎镇痛、抗糖尿病、提高认知能力等效果。目前研究已从坚龙胆中发现了大量的化合物，主要包括环烯醚萜类、三萜类、黄酮类、木质素类和苯甲酸酯类等化学结构。专利技术人于2010年从坚龙胆(Gentiana rigescens Franch)提取物低极性部分中发现了一类具有新化学结构的苯甲酸酯类化合物(n
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GS)，能显著促进PC12细胞神经突起分化，具有拟神经因子活性，并证明n
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GS可以缓解东莨宕碱诱导的痴呆模型鼠的记忆缺失等症状。在此基础上通过构效关系研究发现以ABG
‑
001为代表的化合物活性最显著，开发为抗AD药物的潜力巨大。此外，环烯醚萜苷类化合物是龙胆中主要的药用成分之一，也是龙胆的特征性成分。其中主要药效成分之一的龙胆苦苷是本次研究的主要内容。
[0010]PC12细胞(pheochromocytoma cells)作为本研究的细胞模型，由大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞系克隆得到，未分化的PC12细胞胞体明亮，形态不规则。在神经生长因子(NGF)作用下，该细胞有明显的神经突起伸长，是典型的神经元分化和NGF作用分子机制研究模型。因此，PC12细胞常用作筛选具有拟NGF活性化合物的细胞模型，即筛选抗AD的先导化合物的细胞模型。PC12细胞与神经细胞结构、功能类似，与神经元相比，PC12细胞培养条件简单，可传代培养。作为神经元细胞模型，在神经生理生化等领域研究得到广泛应用。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的之一是提供一类龙胆苦苷衍生物，具有下式(I)或(II)所示结构：
[0012][0013]式(I)中，R1为
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CH2CH3，R2为H或
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COOCH2CH3，依次记为化合物2、3；
[0014][0015]式(II)中，R3为
‑
COOCH2CH3或
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COCH3，依次记为化合物4、5。
[0016]本专利技术另一目的是提供龙胆苦苷(本专利技术中记为化合物1)以及上述龙胆苦苷衍生物(即化合物2～5)的制备方法。
[0017]龙胆苦苷的制备方法，包括：将中药龙胆在室温下于甲醇中浸泡提取，过滤所得滤液浓缩，用水溶解后，依次用正己烷、乙酸乙酯和正丁醇分配，得到活性正丁醇层，用ODS开放式色谱柱分离正丁醇馏分，并用体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、70:30、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一类龙胆苦苷衍生物，其特征在于，具有下式(I)或(II)所示结构：式(I)中，R1为
‑
CH2CH3，R2为H或
‑
COOCH2CH3，依次记为化合物2、3；式(II)中，R3为
‑
COOCH2CH3或
‑
COCH3，依次记为化合物4、5。2.一种龙胆苦苷的制备方法，其特征在于，包括：将中药龙胆在室温下于甲醇中浸泡提取，过滤所得滤液浓缩，用水溶解后，依次用正己烷、乙酸乙酯和正丁醇分配，得到活性正丁醇层，用ODS开放式色谱柱分离正丁醇馏分，并用体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、70:30、90:10和100:0的MeOH/H2O洗脱得到七个组分，其中第三个组分通过HPLC纯化，得到龙胆苦苷；所述HPLC纯化的条件包括：色谱柱Cosmosil 5C30
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UG
‑
5Φ10
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250mm，流动相MeOH/H2O体积比30:70，流速3mL/min，检测波长210nm，保留时间44min。3.一种根据权利要求1所述的龙胆苦苷衍生物的制备方法，其特征在于，所述龙胆苦苷衍生物为化合物2，其制备方法包括：在室温下，向龙胆苦苷的无水甲醇溶液中加入三苯基膦氯化铑，在H2氛围下反应后过滤，真空浓缩，然后通过ODS柱色谱分离，洗脱剂MeOH/H2O体积比20:80，然后通过HPLC纯化，得到化合物2；所述HPLC纯化的条件包括：色谱柱SP
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ODS
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AΦ20
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250mm，流动相MeOH/H2O体积比15:85～50:50梯度洗脱60min，流速10mL/min，检测波长210nm，保留时间24.0min。4.一种根据权利要求1所述的龙胆苦苷衍生物的制备方法，其特征在于，所述龙胆苦苷衍生物为化合物3，其制备方法包括：在室温下，向焦碳酸二乙酯和三氟甲基磺酸钪的无水甲苯/乙醇混合溶液中加入化合物2；所得混合物在50～60℃加热搅拌反应后，冷却至室温，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应，过滤、真空浓缩，浓缩物用EtOAc萃取，有机相经Na2SO4干燥、过滤和浓缩，所得粗样通过硅胶柱色谱分离，洗脱剂DCM/MeOH体积比90:10，然后通过HPLC纯化，得到化合物3；所述HPLC纯化的条件包括：色谱柱5C18
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【专利技术属性】
技术研发人员：戚建华，王颖，陈丹妮，向兰，刘倩，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：