一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途制造技术

一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途，多核苷酸含有的碱基对长度为50～300bp。本发明专利技术首次制备了无需打断的标准品，解决了商业化甲基化pUC19标准品单独打断后回收率低、转化率低、无法质控的问题。无法质控的问题。无法质控的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途


[0001]本专利技术涉及甲基化测序
，具体涉及一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途。

技术介绍

[0002]早在1925年，在DNA双螺旋结构鉴定之前，DNA甲基化修饰就已经被发现。DNA甲基化修饰最主要的形式是5mC(5
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甲基胞嘧啶)及其衍生修饰，被认为是DNA的“第五种碱基”。DNA甲基化在基因调控、遗传印迹、衰老、炎症、肿瘤等生理病理过程中发挥着重要作用。最近研究表明，cell
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free DNA(以下简称cfDNA)甲基化特征是肿瘤早期筛查的重要标志物。
[0003]重亚硫酸盐可将胞嘧啶(C)脱氨基转化为尿嘧啶(U)，在随后的PCR过程中，采用U 耐受的聚合酶，将U识别为胸腺嘧啶(T)，实现C
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>T的转化，从而达到将未修饰C和甲基化修饰C分开的目的。全基因组重亚硫酸盐(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)，将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶(约95％的C会被转化为T)，可覆盖全基因组70～99％的胞嘧啶，实现全基因组水平单碱基分辨率甲基化检测。全基因组重亚硫酸盐测序也是甲基化检测的一个“金标准”。但是重亚硫酸盐处理会使DNA大量降解，需要较高的DNA投入量，对于DNA含量较少的样本不友善，例如血浆游离DNA。另外重亚硫酸盐是将未甲基化的胞嘧啶转化成T，而未甲基化的胞嘧啶占基因组所有胞嘧啶的95％以上，因此，使用重亚硫酸盐处理后构建的二代测序文库，碱基平衡性差(A、T碱基总数占比>80％)，测序时需要添加 15％的噬菌体PhiX DNA平衡，造成测序数据大量浪费。最后WGBS产生的数据测序质量差，而且比对到基因组时需要使用特殊的软件(例如Bismark)，比对率较差，通常只有70％左右，进一步造成数据的浪费。
[0004]已公开的中国专利《全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库及构建》(公开号CN 110 820050 A)表明，在一定条件下，甲基化C可以被十
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十一易位(Ten
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Eleven Translocation， TET)酶转为羧基化C，通过有机硼烷(包括但不限于吡啶硼烷)可以将羧基化的C转化成二氢尿嘧啶，经过测序，可以识别为T，进而区分甲基化C与未甲基化C。基于此原理专利技术的全基因组甲基化非亚硫酸盐文库构建技术，有效解决了文库复杂度低和测序数据深度低的缺陷，同时可实现在多种二代测序平台的甲基化检测。
[0005]公开号为CN 110820050 A的中国专利提及将gDNA混合甲基化pUC19内参后打断，再进行非重亚硫酸盐测序，用甲基化pUC19作为阳参，来质控整个流程的转化率情况。但是这种质控方法并不适用于cfDNA样本，因为cfDNA长度通常只有140～160bp，在二代测序过程中无需打断，需要单独打断甲基化pUC19参考品之后，再与cfDNA混合。
[0006]另一方面，市面上商业化的5mC甲基化DNA标准品浓度较低且价格非常昂贵，例如美国ZYMO公司销售的5mC甲基化pUC19标准品，其浓度只有1ng/μL，每管总量只有20ng，售价上千元，而且在使用打断仪(covaris)单独进行打断时，损失严重，通常打断后的回收率只有约1～10％，回收浓度低至0.01ng/μL，低于市面常见的安捷伦2100和Qsep100等DN A片段分析仪的检测范围，所以打断后的片段分布通常不能知晓，无法确认打断是否正常。除了回
收率低和无法质控片段大小的弊端，甲基化pUC19单独打断后，添加到cfDNA中，经过非重亚硫酸盐测序方法检测，其5mC到T的转化率较低，通常只有约65％，而且比对到 pUC19的reads转化率随5
’‑3’
方向递减，说明单独打断过程造成了该标准品某种变化，导致其无法被完全转化，因此无法作为cfDNA样本的质控品。

技术实现思路

[0007]根据第一方面，在一实施例中，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸含有的碱基对长度为 50～500bp。
[0008]根据第二方面，在一实施例中，提供一种标准品，所述标准品包含第一方面所述多核苷酸。
[0009]根据第三方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒含有第二方面的标准品，或第一方面所述多核苷酸。
[0010]根据第四方面，在一实施例中，提供第一方面所述多核苷酸，或第二方面所述标准品，或第三方面所述试剂盒在免亚硫酸氢盐甲基化检测中的用途。
[0011]依据上述实施例的一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途，本专利技术首次制备了无需打断的多核苷酸标准品，解决了商业化甲基化pUC19标准品单独打断后回收率低、转化率低、无法质控、无法作为cfDNA阳性标准品的问题。
附图说明
[0012]图1为打断后的甲基化pUC19作为cfDNA的阳性标准品，TaqI
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v2酶切和NGS生信分析检测5mC到T的转化率结果图；
[0013]图2A、图2B为pUC19
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mapped reads位点CpG转化率结果图；
[0014]图3为140～160bp甲基化DNA作为cfDNA的阳性标准品，TaqI
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v2酶切和NGS生信分析检测5mC到T的转化率结果图；
[0015]图4为140～160bp甲基化DNA制备效果酶切鉴定结果图。
具体实施方式
[0016]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0017]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
[0018]本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，
位点之间可以不间隔其他碱基，也可以间隔至少一个其他碱基，间隔碱基的数量不受限制。
[0029]在一实施例中，多核苷酸的其中一条单链含有5～20个CpG位点。此处仅仅是示例性列举，多核苷酸含有的CpG位点数不受限制。
[0030]在一实施例中，多核苷酸的其中一条单链含有7～13个CpG位点。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有的碱基对长度为50～500bp。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有的碱基对长度为50～350bp，优选为100～300bp，更优选为140～160bp。3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有至少一个CpG位点。4.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的其中一条单链至少5个CpG位点；和/或，所述多核苷酸的其中一条单链含有5～20个CpG位点；和/或，所述多核苷酸的其中一条单链含有7～13个CpG位点。5.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有至少一个酶切位点。和/或，所述多核苷酸含有至少两个酶切位点；和/或，所述多核苷酸含有两个酶切位点；和/或，所述酶切位点包括限制性核酸内酶酶切位点；和/或，所述限制性核酸内切酶包括I类酶、Ⅱ类酶中的至少一种；和/或，所述Ⅱ类酶包括TaqI酶、HpaII酶中的至少一种。6.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为双链DNA；和/或，所述多核苷酸为非人源的多核苷酸。7.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中含有未甲基化的胞嘧啶；...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳慧，沈璐，赵美茹，钟文星，李俊，易鑫，赵蔷，
申请(专利权)人：深圳吉因加医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：