一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用技术

本发明专利技术公开了一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法，及其衍生而成的嵌合毒素与应用，涉及于生物医药技术领域领域，所述靶向肽筛选方法包括慢病毒包装及稳定细胞系构建；利用表达和不表达vGPCR蛋白的细胞系交替进行噬菌体筛选，His

【技术实现步骤摘要】
一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用。

技术介绍

[0002]卡波氏肉瘤病毒(Kaposi
,
s sarcoma associated herpesvirus,KSHV)，又称人类疱疹病毒8型(HHV
‑
8)，在全球范围内KSHV引发的肿瘤约占病原感染相关肿瘤总病例数的2％，其诱导的肿瘤类型包括卡波氏肉瘤(Kaposi
’
s Sarcoma,KS)、原发渗出性淋巴瘤(Primary Effusion Lymphoma,PEL)以及多中心性Castleman病(Multicentric Castleman
’
s disease,MCD)等，PEL目前尚无最佳治疗方案且预后很差，平均生存时间仅为6个月左右；KS是艾滋病患者在HIV滴度得到控制的情况下发生死亡的主要病因之一。
[0003]KSHV生命周期存在潜伏期和裂解复制期的两个感染阶段，由KSHV开放读码框ORF74编码的病毒G蛋白偶联受体(vGPCR)在裂解复制期高表达，对驱动KSHV诱变宿主细胞癌变过程及维持潜伏感染至关重要。因此，清除vGPCR表达的肿瘤细胞，对KSHV相关肿瘤的治疗至关重要。
[0004]裂解肽可通过在生物膜上寡聚，形成孔道，从而破坏细胞膜，杀死肿瘤细胞。相较于肿瘤治疗常规治疗药物，裂解肽的使用不存在耐药性问题。此外，肿瘤细胞表面负电性的磷脂酰丝氨酸水平略高于正常细胞，带正电性的裂解肽对于肿瘤细胞的杀伤活性高于正常细胞。同时，由于裂解肽含有D型氨基酸，能有效防止其被细胞内蛋白水解酶水解，从而延长作用效果；靶向结合短肽，其合成工艺成熟稳定，具有良好的肿瘤穿透能力，不易在体内诱发免疫应答，具有良好的应用前景，因此，研发vGPCR靶向肽对于KSHV相关的肿瘤的诊疗具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用，所述靶向肽能够高效地识别结合vGPCR蛋白，基于此靶向肽构建的嵌合毒素分子能够有效选择性杀伤KSHV相关肿瘤细胞，抑制肿瘤的进展，可被进一步开发为抗肿瘤药物，同时该靶向短肽也可被改造用作于以vGPCR为靶点的间接酶联免疫反应、免疫印迹和免疫组化等检测方法的试剂，用于基础研究和临床诊治的应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案是：
[0007]一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法，其特征在于，所述靶向肽筛选方法包括利用表达和不表达靶蛋白的细胞多轮交替筛选，具体步骤包括：
[0008]步骤1、慢病毒包装及稳定细胞系构建；
[0009]步骤2、噬菌体库的筛选；
[0010]步骤3、His
‑
vGPCR及vGPCR1
‑
51
‑
Fc蛋白纯化；
[0011]步骤4、结合vGPCR蛋白短肽的单克隆候选噬菌体的筛选。
[0012]优选的，步骤3采取四轮噬菌体淘选，淘选条件如下：
[0013]第1轮至第3轮淘选采用表达目标蛋白的vGPCR
‑
GFP/HEK293T细胞系，第4轮采用不表达目标蛋白的GFP/HEK293T细胞系，5％BSA封闭时间依次是15min、30min、45min和60min，噬菌体原始库与封闭后的细胞悬液结合时间依次是60min、45min、30min和60min。
[0014]本专利技术还保护vGPCR蛋白靶向肽的衍生物在以vGPCR为靶点的检测试剂中的应用。
[0015]本专利技术还保护vGPCR蛋白靶向肽的衍生物在KSHV相关肿瘤诊断或治疗中的应用。
[0016]本专利技术还提供了一种靶向vGPCR的嵌合毒素，包括所述的靶向肽、连接肽和裂解肽，该嵌合毒素氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0017]本专利技术还保护靶向vGPCR的嵌合毒素作为制备KSHV相关肿瘤靶向药物的应用。
[0018]以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。
附图说明
[0019]图1：嵌合毒素的结构图；
[0020]图2：不同抗原包被下单克隆噬菌体亲和力分析结果分析图；
[0021]图3：免疫荧光检测3条候选短肽的结合特异性结果分析图；
[0022]图4：嵌合毒素对于KSHV相关肿瘤细胞的杀伤活性结果分析图；
[0023]图5：嵌合毒素对KSHV相关肿瘤细胞凋亡的影响结果分析图；
[0024]图6：异种移植小鼠荷瘤模型中FL
‑
Lytic有效抑制PEL肿瘤进展结果分析图。
具体实施方式
[0025]以下参考说明书附图介绍本专利技术的多个优选实施例，使其
技术实现思路
更加清楚和便于理解。本专利技术可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本专利技术的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。在本专利技术的构思前提下对本专利技术vGPCR蛋白靶向肽筛选方法及嵌合毒素的简单改造，均属本专利技术要求保护的范围。
[0026]下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明均为本
常规试剂、方法和设备。
[0027]实施例1：特异结合vGPCR蛋白的短肽的筛选
[0028]具体操作如下：
[0029]一、慢病毒包装及稳定细胞系构建
[0030]1.质粒构建：vGPCR及GFP以EcoRI/XbaI、XbaI/NotI插入到pLVX IRES Puro载体，测序成功后使用STBL3进行扩增，同时扩增VSVG、pSPAX并进行质粒大抽。
[0031]2.细胞铺板：将HEK293T接种于10cm dish，细胞密度长至60
‑
70％。
[0032]3.慢病毒包装：
[0033]1)量取1.25μg VSVG、3.5μg pSPAX2以及5μg重组质粒加入到500μL无血无抗DMEM培养基中，加入30μL PEI，充分混匀后静置20min。
[0034]2)转染6h后，换成完全培养基，24、48、72h收集上清。
[0035]4.慢病毒纯化：4000rpm离心5min取上清，0.45μm滤器过滤后12000g离心2h，弃上清，加入100μL无血无抗DMEM静置2h后重悬，20μL/管分装，
‑
80℃保存。
[0036]5.慢病毒感染及稳定细胞系筛选：
[0037]1)HEK293T接种于24孔板，待长至60
‑
70％进行慢病毒感染。
[0038]2)感染前病毒提前0.5h冰上解冻，HEK293T换成无血无抗DMEM培养基。
[0039]3)加入20μL病毒液后室温2500g离心感染1h，37℃孵育1h后换成完全培养基，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法，其特征在于，所述靶向肽筛选方法包括利用表达和不表达靶蛋白的细胞多轮交替筛选，具体步骤包括：步骤1、慢病毒包装及稳定细胞系构建；步骤2、噬菌体库的筛选；步骤3、His
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vGPCR及vGPCR1
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51
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Fc蛋白纯化；步骤4、结合vGPCR蛋白短肽的单克隆候选噬菌体的筛选。2.如权利要求1所述vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法，其特征在于，所述步骤3采取四轮噬菌体淘选，淘选条件如下：第1轮至第3轮淘选采用表达目标蛋白的vGPCR
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GFP/HEK293T细胞系，第4轮采用不...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏芳，郑响，蔡启良，丁玲，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：