检测NTRK基因融合的FISH探针系统及方法技术方案

本发明专利技术公开了检测NTRK基因融合的FISH探针系统及方法。本发明专利技术的探针系统设计巧妙，实现了在一张标本切片上单次FISH同时检测三种NTRK基因融合的状态，快速确定患者是否存在三种NTRK基因融合，节省了标本和试剂，大大缩短了检测的时间。本发明专利技术对三种NTRK基因的联合检测，提高了预后预测的灵敏度和准确性，并根据检测结果选择相对应的分子靶向药物，能够更可靠地指导临床治疗方案制定，从而改善预后。从而改善预后。

【技术实现步骤摘要】
检测NTRK基因融合的FISH探针系统及方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及检测NTRK基因融合的FISH探针系统及方法。

技术介绍

[0002]神经营养因子受体络氨酸激酶(Neuro Trophin Receptor Kinase，NTRK)基因包括NTRK1、NTRK2和NTRK3，分别负责原肌球蛋白受体激酶(TRK)家族蛋白TRKA、TRKB和TRKC的合成。TRK激酶被磷酸化后，能够激活下游信号分子，从而起到调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡等作用。NTRK基因可以与其他不相关的基因发生融合，使得TRK融合蛋白处于持续活跃状态，导致Trk激酶的高表达或者Trk激酶活性持续升高，从而引发下游信号通路永久性级联反应，最终可能引起癌症的发生。
[0003]NTRK基因融合在多种成人和儿童的实体瘤中均有发现，NTRK1、NTRK2、NTRK3融合突变占比分别为45％、2％和53％。NTRK基因融合在部分罕见癌症类型如先天性肾瘤、婴儿肉瘤、唾液腺癌和分泌型乳腺癌等癌种中有极高的突变率，个别癌种出现频率大于90％，因此具有极高的临床应用价值。
[0004]TRK抑制剂拉罗替尼(Larotrectinib，LOXO
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101)是一种有效且具有高选择性的一代TRK抑制剂，用于治疗NTRK基因融合并无已知的获得性抗性突变的转移性或无法手术切除的实体瘤患者。它的作用机制是竞争性结合TRK受体的ATP结合位点，干扰TRK激酶结构域的自磷酸化，从而抑制下游信号的传导。Larotrectinib给药后30～60分钟可达到最大血药浓度，且在所有剂量水平下，对TRK受体的抑制作用都达到了98％。Bayer和Loxo Oncology在2018年的欧洲肿瘤内科学年会(ESMO大会)上宣布，Larotrectinib在NTRK基因融合肿瘤的治疗中产生81％的高应答率。综合来说，Larotrectinib在NTRK融合阳性肿瘤患者治疗中具有良好活性。
[0005]恩曲替尼(Entrectinib，RXDX
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101)是一种口服、具中枢神经系统作用活性的、针对NTRK1/2/3、ROS1和ALK驱动基因的酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗NTRK融合型实体瘤患者，既往治疗后进展的局部晚期或转移性实体瘤患者，无标准治疗方案实体瘤患者的初始治疗。恩曲替尼缩小了一半以上(57.4％)的NTRK基因融合阳性、局部进展或转移性实体瘤患者的肿瘤，反应时(DoR)为2.8～26个月，对乳腺癌、胆管癌、结直肠癌、妇科肿瘤、神经内分泌肿瘤、非小细胞肺癌、唾液腺癌、胰腺癌、肉瘤、甲状腺癌等多种实体肿瘤均有效。可见，恩曲替尼也是一款“广谱”抗癌药。“广谱”是指只基于肿瘤驱动基因而不考虑原发部位。
[0006]因此，拉罗替尼(Larotrectinib)和恩曲替尼(Entrectinib)对不同肿瘤类型的NTRK融合患者已经显示出非常好的疗效，检测肿瘤患者NTRK基因融合状态，有助于筛选出Larotrectinib/Entrectinib的敏感人群，指导临床用药。
[0007]目前，有多种方法可用于检测NTRK基因融合突变，包括荧光原位杂交(FISH)、免疫组化(IHC)、荧光定量PCR(RT
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PCR)和高通量测序(NGS)等方法。
[0008]NGS是一种精确检测NTRK基因融合的方法，具有高通量、高灵敏度、高特异性等优点。基于NGS技术的检测方法不仅可以检测组织样本中的NTRK基因融合，同时也可以通过血
浆和胸水等多种样本检测基因融合状态。NGS检测技术灵敏度远高于目前传统检测技术，可以检出0.1％的融合突变，并可以进行DNA、RNA多层面检测以确保检测准确性。然而，不同大小的NGS panel往往需要设计RNA或DNA探针，来捕获这三个基因，特别是较大的NTRK2和NTRK3基因(DNA片段分别长达39万和35万碱基对)，外显子较多，融合类型复杂且分布不一，只能针对已知融合位点(序列)设计捕获探针，成本较高，操作繁琐，耗时长。
[0009]RT
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PCR法灵敏度高，检测样本选择也较为灵活，但是只可检测已知突变，且NTRK融合断点可位于外显子和内含子。三种亚型较长的基因序列造成了融合断点的多变性，给RT
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PCR的体系设计造成极大的挑战。
[0010]对于IHC法，目前文献报道的Pan
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TRK抗体有两种，克隆号分别为EPR17341和C17F1的兔单克隆抗体。Gatalica Z等人的报道显示前者抗体的灵敏度为75％，与NGS的方法相比会漏诊一些NTRK融合患者；Murphy等人的研究结果显示C17F1抗体具有100％阴性预测值，不会有漏诊情况，但阳性预测值仅为9.3％。因此，Pan
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TRK抗体存在灵敏度低或阳性预测值低的问题，用于NTRK融合检测还需要进一步优化。
[0011]FISH往往被认为是检测基因融合的金标准，其具有稳定性高、灵敏度高、特异性好，实验周期短等优点，但是一组常规的FISH探针通常只能检测一个靶标，只能用于一个基因的融合突变检测。例如，公开号为CN109988836A的中国专利申请公开了一种检测NTRK融合的FISH探针组及其应用，采用的就是常规的FISH探针，一次只能用于一种基因的融合检测。NTRK有3个基因，位于三条染色体上，那么就需要进行三次FISH探针的检测，对NTRK1、NTRK2和NTRK3进行分开检测。

技术实现思路

[0012]本专利技术的目的在于提供一种非同常规的检测NTRK基因融合的FISH探针系统及方法，能够在一张标本切片上同时检测NTRK1、NTRK2和NTRK3三种基因融合。一方面，三种基因的联合检测提高了预后预测的灵敏度和准确率，能够更好地指导临床用药；另一方面，三种基因的一次性检测，能显著地节约肿瘤组织，且大大缩短了检测的时间和成本，对于肿瘤患者，尤其是晚期肿瘤患者，意义重大。
[0013]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0014]本专利技术的第一方面，在于提供同时检测三种NTRK基因融合的FISH探针系统，包含：
[0015]标记第一荧光素的第一探针，其与NTRK1基因断裂点5
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端杂交；
[0016]标记第二荧光素的第二探针，其与NTRK1基因断裂点3
’
端杂交；
[0017]标记第三荧光素的第三探针，其与NTRK2基因断裂点5
’
端杂交；
[0018]标记第四荧光素的第四探针，其与NTRK2基因断裂点3
’
端杂交；
[0019]标记第一荧光素的第五探针，其与NTRK3基因断裂点5
’
端杂交；
[0020]标记第二荧光素的第六探针，其与NTRK3基因断裂点3
’
端杂交；
[0021]标记第五荧光素的第七探针，其与NTRK3基因断裂点5<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.同时检测三种NTRK基因融合的FISH探针系统，包含：标记第一荧光素的第一探针，其与NTRK1基因断裂点5
’
端杂交；标记第二荧光素的第二探针，其与NTRK1基因断裂点3
’
端杂交；标记第三荧光素的第三探针，其与NTRK2基因断裂点5
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端杂交；标记第四荧光素的第四探针，其与NTRK2基因断裂点3
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端杂交；标记第一荧光素的第五探针，其与NTRK3基因断裂点5
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端杂交；标记第二荧光素的第六探针，其与NTRK3基因断裂点3
’
端杂交；标记第五荧光素的第七探针，其与NTRK3基因断裂点5
’
端和3
’
端杂交；其中，第一荧光素、第二荧光素、第三荧光素、第四荧光素、第五荧光素为不同颜色的荧光素。2.如权利要求1所述的FISH探针系统，其特征在于，第一荧光素为绿色荧光素，第二荧光素为橙色荧光素，第三荧光素为蓝色荧光素，第四荧光素为红色荧光素，第五荧光素为金色荧光素。3.如权利要求1所述的FISH探针系统，其特征在于，第一探针位于chr1:156,824,627
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157,312,258；第二探针位于chr1:156,355,849
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156,684,745；第三探针位于chr9:86,545,621
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87,292,312；第四探针位于chr9:87,958,032
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88,102,082；第五探针位于chr15:88,064,591
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88,268,902；第六探针位于chr15:88,734,571
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89,472,835；第七探针位于chr15:87,684,180
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89,869,300。4.如权利要求1～3中任一项所述的FISH探针系统，其特征在于，通过以下方式制得：所述的第一～第七探针通过以下步骤制得：利用携带有检测基因的BAC菌种，获得所述检测基因的克隆后，提取所述检测基因的DNA；根据设计的杂交位点，选定限制性内切酶对所述检测基因的DNA进行两次酶切，得到所述检测基因的小片段DNA探针；再采用缺口平移的方法将选定的荧光素标记连接到所述检测基因的小片段DNA探针上，纯化得到所述检测基因的探针；所述检测基因为NTRK1、NTRK2或NTRK3基因。5.如权利要求4所述的FISH探针系统，其特征在于，携带有NTRK1基因的BAC菌种，编号为RP11
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107B...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢红阳，张谷，樊滢，
申请(专利权)人：浙江省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：