一种手动固相合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法技术

本发明专利技术公开了一种多肽合成的方法，涉及使用缩合试剂DIC/Oxyma手动高效合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4。本发明专利技术发现过量的Oxyma能显著增加合成效率，且能有效降低外消旋等副反应。本发明专利技术通过分析型反相高效液相色谱、质谱和圆二色谱对合成多肽进行验证，发现1当量树脂(Rink Amide AM树脂或Wang树脂)，4当量的氨基酸，4当量的DIC，8当量的Oxyma缩合体系，在50℃条件下，通过手动固相合成方法，可以避免前人技术的缺点(如反应效率低、反应条件苛刻、氨基酸消旋、氨基酸氧化等)，实现了蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的高效、经济、温和制备。本发明专利技术为多肽的产业化制备提供了技术支持。持。

【技术实现步骤摘要】
一种手动固相合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法


[0001]本专利技术涉及多肽制药领域，具体是指一种采用过量Oxyma对一种蜈蚣毒素多肽RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的高效手动合成方法。

技术介绍

[0002]肽类分子在疾病治疗、生物成像和诊断等领域得到广泛应用。基于Fmoc的固相多肽合成是制备多肽类分子的常用方法。偶联试剂介导一个氨基酸的羧酸和另一个氨基酸的氨基形成酰胺键，在SPPS过程中发挥关键作用。常用偶联试剂为碳二亚胺类化合物(如N,N'
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二异丙基碳二亚胺，DIC)，受保护的氨基直接与经DIC活化的氨基酸反应会发生较高的消旋率，增加分离纯化的难度且影响产物的合成效率和产率。且DIC酯会消耗变为没有反应活性的酰基脲，浪费反应物。为了减少传统偶联试剂引起的外消旋化等副反应，化学家开发了一系列外消旋抑制剂，如广泛使用的1
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羟基
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氮杂苯并三氮唑(HOAt)和1
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羟基苯并三唑(HOBt)。基于HOBt结构的消旋抑制剂在使用过程中存在着潜在的爆炸风险，已被多个国家禁用。2
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肟氰乙酸乙酯(Oxyma)是一种新型的外消旋抑制剂，可以抑制碳二亚胺法形成肽键过程中的外消旋化。Oxyma具有强吸电子基团氰基肟，能够与DIC活化的羧酸发生酰基转移，碳二亚胺离去，然后Oxyma活性酯与氨基酸反应，Oxyma离去，生成酰胺键。与传统的HOBt和HOAt等外消旋抑制剂相比，Oxyma具有廉价、安全、缩合效率高、兼容手动和微波固相多肽合成等优势。
[0003]新型缩合剂Oxyma目前是多肽固相合成与DIC常用的缩合试剂。本专利技术发现加入过量Oxyma能显著提高合成速率，且能有效降低消旋体。本专利技术公开了一种多肽合成的方法，涉及使用缩合试剂DIC/Oxyma手动高效合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4。
[0004]蜈蚣毒素RhTx和RhTx毒素的价值：RhTx毒素来自于具有攻击性的中国红头蜈蚣。RhTx是一种小型紧凑的多肽毒素，含有27个氨基酸残基。RhTx分子中含有两对二硫键，第5位的Cys(半胱氨酸)和第16位的Cys形成一对二硫键，第10位的Cys和第23位的Cys形成另一对二硫键。RhTx多肽的N
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端比较灵活多变，而多肽近C
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端的一半片段中几乎聚集着所有的富电荷残基。正是由于富电荷残基聚集在多肽分子的一端，使得RhTx毒素成为一个极性分子。RhTx毒素选择性作用于TRPV1离子通道，是非常有效的TRPV1通道激活剂，能够特异性激活TRPV1的胞外区，通过诱导构象重排，干扰离子渗透，产生剧烈的疼痛，具有高效亲和力和高度特异性。然而，RhTx在自然界中的含量较低，因此人工合成RhTx来弥补天然毒素来源不足的问题是非常有必要的。
[0005]GsMTx4蜘蛛毒素和GsMTx4蜘蛛毒素的价值：GsMTx4毒素是从Grammostola spatulata蜘蛛的毒素中提取得到的。GsMTx4毒素含有34个氨基酸以及三对二硫键。GsMTx4第2位的Cys和第17位的Cys形成第一对二硫键，第9位的Cys和第23位的Cys形成第二对二硫键，第16位的Cys和第30位的Cys形成第三对二硫键。Piezo通道作为一个多功能的机械敏感的阳离子通道，能够介导触觉，血管发育和本体感觉。更重要的是Piezo的突变与涉及机械传导的多种遗传性人类疾病有关。所以Piezo通道可以作为一个重要的潜在治疗靶点。
GsMTx4毒素是目前报道的唯一的特异性靶向Piezo通道的抑制剂。GsMTx4的自然丰度较低，传统的蛋白质重组表达等方法难以获取足量的目标多肽，化学方法是获取足量GsMTx4的有效途径。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是，提供一种手动高效化学合成蜈蚣毒素RhTx毒素和蜘蛛毒素GsMTx4的方法，选择DIC/Oxyma作为缩合剂，在50℃条件下，手动高效固相合成蜈蚣毒素RhTx毒素和蜘蛛毒素GsMTx4。本专利技术发现过量的Oxyma能显著增加合成速率，且有效降低外消旋化等副反应。
[0007]基于上述目的，本专利技术所涉及的技术方案如下：
[0008]1)合成树脂处理：取0.32mmol/g Rink Amide AM树脂180mg置于多肽合成管。首先，分别用如下溶剂在多肽合成管中对树脂进行清洗，DMF洗两次，DCM洗两次，DMF洗一次，DCM洗一次，DMF洗三次，抽干溶剂(标准洗)。然后，加入4mL DMF，在室温下浸泡溶胀1h，再按上述标准洗的方法洗一次。最后，4mL DMF/DCM(1:1，v/v)的混合溶剂加入含有树脂的合成管中，28℃恒温振荡器，80
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100转/分钟，活化树脂30min，再按上述标准洗方法洗一次。
[0009]2)氨基酸缩合：本专利技术多肽合成过程中每个氨基酸(除缩合精氨酸之外)缩合过程如下：采用Fmoc保护基的氨基酸(4当量)，DIC(4当量)，缩合剂Oxyma(8当量)，溶于DMF配成缩合试剂，在室温下活化4分钟后，加入合成管，在50℃恒温振荡缩合两次，根据Kaiser检验结果，第一次反应时间为10
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15min，第二次反应时间为15
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30min。
[0010]3)氨基酸连接完成后脱除Fmoc保护基的方法：在50℃恒温振荡的条件下，20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱除Fmoc保护基团。反应两次，反应时间分别为3min和6min。取少量树脂，通过Kaiser测试检测脱除的程度。
[0011]4)精氨酸缩合：Fmoc
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Arg(Pbf)
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OH(4当量)，HCTU(3.7当量)，DIEA(8当量)，先后溶于DMF中配成缩合试剂，摇匀。然后，将反应液迅速加入合成管中，28℃恒温振荡条件下缩合两次，反应时间分别是30min和50min。最后，在28℃恒温振荡条件下，用20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，脱除2次，反应时间分别为5min和10min。
[0012]5)全部氨基酸连接完成，将多肽从树脂切除的过程：首先将反应后的树脂按上述标准洗方法洗一次，然后在28℃恒温振荡的条件下用含有20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基两次，每次反应时间分别为5min和10min。使用DMF和DCM交替清洗六次，然后使用DCM冲洗树脂至少5次，用水泵和油泵分别抽真空6分钟。最后加入切肽试剂(三氟乙酸/苯酚/水/苯甲硫醚/1，2
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乙二硫醇，82.5:5:5:5:2.5，v/v/v/v/v，提前预冷至大约4℃)，在28℃恒温振荡器条件下反应2.5
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3小时。
[0013]6)沉淀方法收集毒素沉淀：用氮气将上述切肽溶液进行鼓泡浓缩至2
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3mL，然后用预冷的冰乙醚将多肽沉淀。然后，3200r/min离心1min，弃去上清液，保留沉淀。上述步骤重复三次，最后将提取的线性粗产品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种采用过量Oxyma对蜈蚣毒素多肽RhTx和蜘蛛毒素多肽GsMTx4的高效手动固相合成方法，其特征在于：1)使用过量Oxyma对一种蜈蚣毒素多肽RhTx和蜘蛛毒素多肽GsMTx4的温和、经济、高效、手动合成方法。2)固相树脂为1摩尔当量，精氨酸之外的其它氨基酸缩合使用的缩合体系是Fmoc保护基的氨基酸(4摩尔当量)、DIC(4摩尔当量)、Oxyma(8摩尔当量)，在50℃气浴恒温振荡条件下缩合两次，第一次反应5
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15分钟，第二次根据氨基酸连接的难易程度和Kaiser检测情况反应10

【专利技术属性】
技术研发人员：杜姗姗，齐昀坤，陈西同，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：