一种松材线虫PAMPBxCDP1的突变体及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种松材线虫PAMP BxCDP1的突变体及应用，属于生物技术领域。BxCDP1的突变体为M9和/或M16，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。突变体M9、M16可提高松树病程相关基因的表达并增强松树抗松材线虫病的能力，可作为有效成分应用于植物免疫诱导剂的开发。本申请通过鉴定BxCDP1触发植物免疫反应的关键氨基酸区域，并发现鉴定到的多肽有助于提高松树抗松材线虫病的能力，为利用植物诱导抗性开发松树抗松材线虫病的免疫诱导剂提供了基础；可利用其诱导免疫抗性，针对松材线虫病的发生发展规律制定防治对策，提高松材线虫病的防治水平，减少化学农药的使用。减少化学农药的使用。减少化学农药的使用。

【技术实现步骤摘要】
一种松材线虫PAMP BxCDP1的突变体及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种松材线虫病原相关分子模式(pathogen
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associated molecular patterns，PAMP)BxCDP1的突变体及其在制备用于防治松材线虫病的免疫诱导剂中的应用。

技术介绍

[0002]松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的一种毁灭性森林病害。松材线虫可危害包括日本黑松(Pinus thunbergii)、马尾松(P.massoniana)等在内的58种松属植物和13种非松属针叶树。目前该病主要分布在日本、中国、韩国、美国、加拿大、墨西哥、葡萄牙和西班牙等国，其中日本、中国及韩国危害最为严重。我国于1982年南京中山陵首次发现该病，目前疫情已扩展到江苏、浙江、安徽、福建等17个省区。与2020年相比，疫区又新增63个县区(国家林业和草原局2021年第5号公告)。近四十年来，松材线虫病在我国的发生日益严重，已对我国的森林资源和生态环境造成严重破坏和不可估量的经济损失，因此松材线虫被列为国内头号森林植物检疫对象。
[0003]松材线虫病的发生发展极为复杂，涉及松树、松材线虫、天牛(传播媒介)、细菌、真菌以及地理环境等多方面，尽管目前存在的三种假说(酶学说、毒素学说和空洞化学说)都由不同的试验证据证实，但松材线虫病确切的致病机理一直没有完全弄清，导致该病防治难度大，效果不佳，松树一旦感病，枯萎死亡的结局不可逆转。对于松材线虫病的生物防治，虽经室内生物活性测定筛选出许多具有高效杀线活性的菌株，但在林间防治效果还不明确，使化学防治成为松材线虫病常用的防治手段之一。虽然研究者已筛选出一些具有防治松材线虫病潜力的药剂，如甲维盐、阿维菌素、氯氟氰虫酰胺和啶虫脒等。但这些化学药剂使用不当易危害松树、污染环境，且成本较高，因而不能在林间大量施用。因此目前对于松材线虫病的防治还没有一个十分有效的方法。
[0004]在自然界中，尽管植物会受到许多病原微生物(包括真菌，细菌，线虫，病毒等)以及昆虫的侵袭，但是由于植物具有的先天免疫使得它们对于大部分的微生物具有抗性。在目前普遍认为的植物免疫系统与病原互作的“Z”字形模式中，植物免疫系统的第一道防卫反应即植物细胞膜上的模式识别受体(PaRemrecognitionreceptors，PRRs)可以识别病原物或微生物相关分子模式(Pathogen
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ormicrobia1
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associated molecular patterns，MAMPs or PAMPs)，从而激发植物基础防卫反应，诱导一些信号通路的激活，阻碍病原物的进一步扩展，即PAMP
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triggered immunity(PTI)。
[0005]植物免疫诱导抗性的研究在国内外已有近百年的历史，科学家们发现了很多对植物具有诱导抗性的功能物质并应用到植物病害的治理实践中。其中PAMPs(又称诱导子或激发子)对植物所产生的抗病信号经内源信号转导物质水杨酸、茉莉酸、乙烯和一氧化氮可转导到整个植株，经过一系列抗病相关基因的调控和表达引起寄主防御酶系统如苯丙氨酸解氨酶、β
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1，3葡聚糖酶、几丁质酶、过氧化物酶等以及抗病物质如木质素与植保素等的变化及病程相关蛋白的调控与表达，以此来抵抗病原菌的侵入和发展，减轻和防治病害的发生。
[0006]生物诱抗剂(或称之为植物疫苗)是利用生物诱导抗性的原理，通过提高植物免疫能力开发的一种新型生物农药，通过调节植物的新陈代谢，激活植物的免疫和生长系统，从而增强植物抗病和抗逆能力。研究开发高活性植物病害疫苗是我国现代农林业研究领域的一个新的重要课题。利用诱导免疫抗性，可以针对植物病害的发生发展规律制定防治对策，提高植物病害的防治水平，减少化学农药的使用，从根本上减少农药对环境的污染。
[0007]目前，我国植物疫苗即抗病诱导剂的研究虽处于起步阶段，但已经取得了一些进展。如，利用寡糖诱导多种植物对植物真菌病害的抗性。利用来源于细极链格孢的激活蛋白诱导多种植物对病毒病等多种植物病害的抗性。这些研究都已商品化，并开始在田间应用，取得了较好的抗病增产效果。目前蛋白类诱导剂除过敏蛋白、隐地蛋白及激活蛋白外，还有一些糖蛋白如疫霉糖蛋白及其13个氨基酸的短肽(pep
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13)，可诱导欧芹细胞瞬时离子流、防卫基因转录和植物保卫素积累。另外，植物病原细菌的PAMPs脂多糖能有效抑制毒性菌株细菌的数量；另一个细菌PAMPs鞭毛蛋白Flagellin及其22个氨基酸(即flg22)能诱导水稻悬浮细胞产生抗病防御反应。这些结果表明作为免疫激发子之一的病原物的PAMPs可被用于作为植物免疫诱导剂的开发，并具有广阔的应用前景。
[0008]申请人前期从松材线虫侵染松树早期转录组数据中筛选和鉴定了1个松材线虫分泌的PAMP BxCDP1(见专利号为ZL201910437852.X，名称为松材线虫的病原相关模式分子蛋白BxCDP1及其应用的中国专利)。研究发现BxCDP1能触发包括寄主松树在内的多种植物的细胞坏死和免疫反应，并能诱导松树产生更强的防卫反应，提高松树对松材线虫的抵抗。但关于其触发植物免疫的关键氨基酸区域及鉴定出的关键氨基酸区域是否能作为植物免疫诱导剂、提高松树抗松材线虫病的能力还不清楚。

技术实现思路

[0009]基于现有技术存在的上述不足，本专利技术所要解决的第一技术问题是提供一种松材线虫PAMP BxCDP1的突变体，并公开了其氨基酸序列及编码基因的核苷酸序列；本专利技术所要解决的第二技术问题是提供上述松材线虫PAMP BxCDP1的突变体的应用，比如在制备用于防治松材线虫病的免疫诱导剂中的应用，在诱导植物免疫反应中的应用。
[0010]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0011]本申请人前期鉴定到松材线虫的1个PAMP BxCDP1，发现BxCDP1触发包括寄主松树在内的多种植物的细胞坏死和免疫反应，它能诱导松树产生更强的防卫反应，提高松树对松材线虫的抵抗。因此将松材线虫病原相关分子模式BxCDP1编码的氨基酸序列分成19段，设计出BxCDP1及其19个删除部分片段的突变体，并通过农杆菌注射成功表达于本氏烟中，筛选到触发本氏烟细胞坏死的最短区域M9、M15及M16(第56
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86aa、第107
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136aa及第153
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173aa)。M9、M15及M16显著诱导本氏烟PTI marker基因的上调表达，能有效诱导本氏烟的免疫反应。且M9和M16能激发寄主松树的病程相关基因的表达，激活松树的防御反应。
[0012]M9和/或M16作为松材线虫PAMP BxCDP1的突变体，突变体M9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变体M16的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]需要说明的是，M9和/或M16突变体的名本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种松材线虫PAMP BxCDP1的突变体，其特征在于，所述突变体为M9和/或M16，突变体M9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变体M16的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的松材线虫PAMP BxCDP1的突变体的编码基因，其特征在于，所述突变体M9的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述突变体M16的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.包含如权利要求2所述的编码基因的重组质粒、表达盒或重组菌。4.一种制备权利要求1所述的松材线虫PAMP BxCDP1的突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2所述的松材线虫PAMP BxCDP1的突变体的编码基因克...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴小芹，胡龙娇，叶建仁，温彤玥，邱依君，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：