一种紫点海葵多肽毒素的制备方法及其抗肿瘤应用技术

本发明专利技术提供一种紫点海葵多肽毒素的制备方法及其应用，其制备方法包括以下步骤：1、海葵粗毒液的提取：活海葵经过饥饿期后，使用手动挤压法或/和电刺激法提取含有海葵粗毒的水溶液，将含有海葵粗毒的水溶液进行冷冻干燥，使用生物CE膜透析袋透析脱盐；2、海葵粗毒分子滤过：将提取得到的海葵粗毒液，使用超滤管进行离心，得到滤过组分；3、海葵毒素的纯化：将步骤2得到的滤过组分经微孔滤膜过滤，通过反相高效液相色谱仪梯度洗脱得到F1

【技术实现步骤摘要】
一种紫点海葵多肽毒素的制备方法及其抗肿瘤应用


[0001]本专利技术涉及海葵
，特别涉及一种紫点海葵多肽毒素的制备方法及其抗肿瘤应用。

技术介绍

[0002]海葵具有用于捕食和防御功能的触手刺细胞，其分泌的毒液主要包含多肽和蛋白类的神经毒素和溶细胞素，迄今为止，已从海葵中分离并鉴定了100多种多肽毒素，能够作用于各种细胞膜离子通道并且具有强心药物和神经毒素的特征。
[0003]国内于90年代初期开始了对海葵多肽毒素的研究，研究表明海葵多肽RSAP
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和RSAPⅡ对豚鼠心室肌细胞钠通道表现出活性，且二者所起的作用恰好相反。从舟山黄海葵中分离纯化了一种新的多肽毒素AX
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1，不仅能使大鼠背根神经节细胞的钠离子通道的失活得到抑制，而且能使钠离子通道的电流得到显著增加，具有较好的兴奋性作用，有望开发成为强心类药物。从青岛侧花海葵中提取的毒素ApQ具有明显的增强心肌收缩的作用。从湛江的侧花海葵中分离得到了多个海葵神经毒素基因,其中重组海葵神经毒素Hk2a能够明显改善慢性充血性心力衰竭(CCHF)新西兰兔的左心室功能。因此，海葵神经毒素一方面可以作为分子探针,研究钠离子通道的结构与功能，另一方面，可以作为一种治疗心力衰竭的药物先导物，研制开发新的治疗心衰的药物。迄今为止，结直肠癌 (colorectal cancer，CRC)是世界上第三常见的恶性肿瘤。在我国，随着饮食结构和生活习惯的变化，患CRC的风险随之增加，应引起足够的关注和重视。
[0004]现有技术中也有利用海葵提取物添加到药物治疗中，例如CN112458138A 公开一种紫点海葵酶解多肽的制备方法及其应用，该专利技术制得紫点海葵多肽具有抗结肠癌的作用。该专利技术需要使用较多的化学试剂和生物试剂进行制备，制得紫点海葵多肽没有说明具有促进结肠癌细胞HCT
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116的凋亡的作用。 CN105030838A公开海葵粗提物的制备方法及其抗肿癌应用，制得海葵粗毒应用在抗肺癌药物的制备中。该专利技术通过反复对海葵进行冻融处理的到海葵粗毒，该方法制得的海葵粗毒杂质较多，增加后续操作步骤。本专利技术通过手动挤压法或/和电刺激法获得海葵粗毒，不仅杂质较少，后续不需要过多步骤即可提取到紫点海葵毒素，而且将提取完毒素的海葵放回海洋环境中，海葵还可以存活。
[0005]因此，急需一种可以使海葵反复利用、操作简易的制备方法提取紫点海葵多肽毒素，通过该方法制备出的紫点海葵多肽毒素不仅有效抑制结肠癌细胞 HCT
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116活性而且能够促进结肠癌细胞HCT
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116的凋亡，且呈剂量依赖性。

技术实现思路

[0006]鉴以此，本专利技术提出一种紫点海葵多肽毒素的制备方法，制得紫点海葵多肽毒素具有高效的抗肿瘤活性，特异性作用于结肠癌细胞HCT
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116，不仅有效抑制结肠癌细胞HCT
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116活性而且能够促进结肠癌细胞HCT
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116的凋亡，且呈剂量依赖性。
[0007]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0008]一种紫点海葵多肽毒素的制备方法，包括以下步骤：
[0009](1)海葵粗毒液的提取：活海葵经过饥饿期后，使用手动挤压法或/和电刺激法提取含有海葵粗毒的水溶液，将含有海葵粗毒的水溶液冷冻干燥，使用生物CE膜透析袋透析脱盐。
[0010](2)海葵粗毒的分子滤过：将提取得到的海葵粗毒液，使用超滤管离心分离，得到滤过组分。
[0011](3)海葵多肽毒素的分离纯化：将步骤(2)得到滤过组分经微孔滤膜过滤，通过反相高效液相色谱梯度洗脱得到F1
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F3组分，收集F1组分进行冷冻干燥，得到纯化后的紫点海葵多肽毒素。
[0012]进一步的，步骤(1)中，所述活海葵饥饿期时长为24～48h。
[0013]进一步的，步骤(1)中，所述手动挤压法的操作为将活海葵清洗干净后手动挤压刺激海葵诱导其刺丝囊释放粗毒液，手动挤压方式为上下搓揉3～7次，每次2～4min。
[0014]进一步的，步骤(1)中，所述手动挤压法的操作为将海葵清洗干净后手动挤压海葵诱导其刺丝囊释放粗毒液，手动挤压方式为手动上下搓揉5次，每次 3min。
[0015]进一步的，步骤(1)中，所述电刺激法的操作步骤为：
[0016](1)预处理：将活海葵放在烧杯中，用镊子去除污染物，丢弃在此过程中排出的腔肠液；
[0017](2)海葵粗毒液水溶液的提取：将活海葵浸泡在装有人工海水的烧杯中，活海葵与人工海水的体积比为1:0.5～1.5，使用两个碳电极对其进行电刺激，电压为80～120V，电流频率为15～25Hz，间歇时间为8～12ms，持续时间为50～70 s，阴极放置在海葵消化循环腔中，阳极放置在海葵柱体和触手附近。
[0018]进一步的，步骤(1)中，活海葵与人工海水的体积比为1:1。
[0019]进一步的，步骤(1)中，所述电刺激法电压为100V，电流频率为20Hz，间歇时间为10ms，持续时间为60s。
[0020]进一步的，步骤(1)中，冷冻干燥的条件为温度为
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60～
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100℃，压力为 12～20Pa，时间为18～30h。
[0021]进一步的，步骤(1)中，冷冻干燥的条件为温度为
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80℃，压力为16Pa，时间为24h。
[0022]进一步的，步骤(1)中，使用生物CE膜透析袋在4℃透析脱盐。
[0023]进一步的，步骤(2)中，使用30kD、10kD和3kD超滤管依次滤过，离心参数为3500～4500r/min，时间为3～5h。
[0024]进一步的，步骤(2)中，离心参数为4000r/min，时间4h。
[0025]进一步的，步骤(3)中，使用反相液相色谱仪进行分离的色谱条件：检测波长为210～220nm，反相色谱柱为C18半制备柱，洗脱液A液为体积百分比 0.08～0.12％三氟乙酸水溶液，B液为乙腈，流速为0.8～1.2mL/min，梯度洗脱程序为：
[0026][0027][0028]1、进一步的，步骤(3)中，使用反相液相色谱仪进行分离的色谱条件：检测波长为214nm，反相色谱柱为C18半制备柱，色谱柱长250mm，内径10mm，洗脱液A液为体积百分比0.10％三氟乙酸水溶液，B液为乙腈，流速为1.0 mL/min。
[0029]2、进一步的，步骤(3)中，冷冻干燥的条件为温度为
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60～
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100℃，压力为 12～20Pa，时间为8～16h。
[0030]3、进一步的，步骤(3)中，冷冻干燥的条件为温度为
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80℃，压力为16Pa，时间为12h。
[0031]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0032](1)采用本专利技术方法制备紫点海葵多肽毒素，不仅绿色环保，而且制得紫点海葵多肽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种紫点海葵多肽毒素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)海葵粗毒液的提取：活海葵经过饥饿期后，使用手动挤压法或/和电刺激法提取含有海葵粗毒的水溶液，将含有海葵粗毒的水溶液进行冷冻干燥，使用生物CE膜透析袋透析脱盐；(2)海葵粗毒分子滤过：将提取得到的海葵粗毒液，使用超滤管离心分离，得到滤过组分；(3)海葵毒素的纯化：将步骤(2)得到的滤过组分经微孔滤膜过滤，通过反相高效液相色谱仪梯度洗脱得到F1
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F3组分，收集F1组分进行冷冻干燥，得到纯化后的紫点海葵多肽毒素。2.如权利要求1所述的一种紫点海葵多肽毒素的制备，其特征在于，步骤(1)中，活海葵饥饿期时长为24～48h。3.如权利要求1所述的一种紫点海葵多肽毒素的制备，其特征在于，步骤(1)中，手动挤压法的操作为将活海葵清洗干净进行手动挤压刺激海葵诱导其刺丝囊释放毒液，手动挤压方式为上下搓揉3～7次，每次2～4min。4.如权利要求1所述的一种紫点海葵多肽毒素的制备，其特征在于，步骤(1)中，电刺激法的操作步骤为：(1)预处理：将活海葵放在烧杯中，用镊子去除污染物，丢弃在此过程中排出的腔肠液；(2)海葵粗毒液水溶液的提取：将活海葵浸泡在装有人工海水的烧杯中，活海葵与人工海水的体积比为1:0.5～1.5，使用两个碳电极对其进行电刺激，电压为80～120V，电流频率为15～25Hz，间歇时间为8～12ms，持续时间为50～70s，阴极放置...

【专利技术属性】
技术研发人员：高炳淼，袁琳，符金星，廖燕玲，
申请(专利权)人：海南医学院，
类型：发明
国别省市：