一种中国鲎抗菌肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种中国鲎抗菌肽（Tatritin）及其制备方法和应用，抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID：4所示，通过实验证实了该抗菌肽对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和嗜水气单胞菌均具有抑菌活性，且对耐药菌株如产超广谱β

【技术实现步骤摘要】
一种中国鲎抗菌肽及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种中国鲎抗菌肽，同时还涉及中国鲎抗菌肽的制备方法及其用途。

技术介绍

[0002]中国鲎(Tachypleus tridentatus)是一种古老的海洋无脊椎动物，最早出现在4.5亿年前的寒武纪，几亿年来其形态基本没有发生变化，被称为“生物活化石”。迄今为止，人类从鲎的血液中分离出50余种生物活性成分，分别具有抗菌、抗病毒和抑制肿瘤的活性。在这些活性物质中，抗菌肽(鲎素)主要发挥抗病原微生物的作用，它的发现被认为是天然抗生素研究的一个里程碑。
[0003]自1928年青霉素问世以来，人类逐渐进入控制和治疗细菌感染性疾病的时代。然而大量抗生素的使用加速了致病菌的进化，使得大量耐药细菌及多重耐药细菌不断出现，细菌对传统抗生素的耐药性已成为全球关注的重大公共卫生问题，而曾在维持人类生命健康方面发挥巨大作用的抗生素也饱受争议。因此，开发替代抗生素的新型抗菌药物显得愈发重要。抗菌肽不仅对细菌和真菌有广谱杀灭作用，而且还具有很好的抗病毒和抗肿瘤作用。另外，与传统抗生素相比，抗菌肽的作用机制独特，能够迅速杀菌且不易引发细菌的耐药性，可单独或与抗生素联合使用杀伤病原体，因此抗菌肽成为一类发展潜力巨大的新型抗菌类药物，在新型抗菌药物开发领域具有巨大的优势。
[0004]相比陆生动物，海洋动物的抗菌肽种类更丰富，也更具有独特性，是抗菌肽生物资源的巨大宝库。已有报道证实，海洋生物中的某些抗菌肽比高等脊椎动物具有更强的杀菌活性，因此，对海洋生物抗菌肽的基础研究与开发利用具有重要的科学意义和潜在应用价值。
[0005]抗菌肽是一类生物来源的具有广谱抗菌活性的天然小分子多肽，通常被认为分子量小于10kDa，带有正电荷。根据结构和功能的不同，可分为杀菌肽(天蚕素)、防御素、富含脯氨酸的抗菌肽(蛙皮素)、富含甘氨酸的抗菌肽(蜂毒素)。其中防御素因其广泛表达于机体各组织和粘膜上皮，是宿主抵抗外界病原微生物入侵的第一道防线，被认为是最重要的一类抗菌肽。然而，天然抗菌肽来源有限，化学合成也存在成本高、批量生产困难的问题。另外抗菌肽的抗菌活性与多肽分子的空间结构密切相关，体外合成的抗菌肽与天然多肽尽管一级结构相同，但空间结构却存在一定差异，导致其活性受到较大的影响。巴斯德毕赤酵母(Pichia pasoris)由于兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工、修饰的特点，且发酵条件简单，表达水平高，适合高密度培养，为工业化生产和纯化回收提供极大的方便。因此，采用基因工程方法制备抗菌肽具有较大优势。

技术实现思路

[0006]本专利技术从中国鲎中克隆得到一种新的抗菌肽基因(命名为Tatritin)，并通过体外化学合成和酵母表达系统高效表达制备重组蛋白的方法制备目标抗菌肽，该抗菌肽可应用
于制备抗菌药物。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]本专利技术所述抗菌肽基因的获得：利用反转录
‑
聚合酶链式反应(RT
‑
PCR)的方法，以中国鲎总RNA为模板，将其反转录成cDNA，然后通过RT
‑
PCR获得中国鲎抗菌肽基因，其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，开放阅读框(ORF)如SEQ ID NO：2所示。
[0009]本专利技术所述中国鲎抗菌肽成熟区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，其制备方法为：
[0010]i.多肽体外化学合成；
[0011]ii.重组蛋白制备：在优选实施例中，以毕赤酵母表达载体pGAPZαA为基础，根据酵母细胞密码子偏好性优化Tatritin基因序列，并在目的基因前引入6
×
His标签便于纯化，插入表达载体的序列如SEQ ID NO：5所示，通过酵母表达系统高效表达制备重组蛋白，利用His标签分离纯化重组蛋白6His
‑
Tatritin。
[0012]本专利技术获得的中国鲎抗菌肽具有抗菌作用：分别采用抑菌曲线法和牛津杯法对化学合成的中国鲎抗菌肽和重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性测定，实验证明中国鲎抗菌肽对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和革兰氏阴性菌如大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和嗜水气单胞菌以及致病真菌如白色念珠菌等均具有良好的抑菌活性。因此，本专利技术的中国鲎抗菌肽可用于制备抗病菌类产品，包括医药产品如抗菌药物，饲料添加剂，兽药，防腐剂等。
[0013]本专利技术的优点和有益效果：本专利技术公开的中国鲎抗菌肽对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和嗜水气单胞菌等均具有良好的抑菌活性，甚至对耐抗生素病原菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和产超广谱β－内酰胺酶大肠杆菌以及顽固致病真菌如白色念珠菌也具有良好的抑菌活性。因此，该抗菌肽可为抗感染及抵抗耐药或顽固型病原菌提供一类疗效显著的新药。而且，本专利技术在化学合成法之外还提供了酵母重组表达制备抗菌肽的方法，能够减少制备费用，缩短生产时间，提高利用效率，有利于工业化生产。
附图说明
[0014]图1为本专利技术所述中国鲎抗菌肽基因RT
‑
PCR扩增产物。1：目的基因；M：2kb DNA分子量标准。
[0015]图2是体外化学合成中国鲎抗菌肽对部分革兰氏阴性和革兰氏阳性菌抑菌活性测定。
[0016]图3是体外化学合成中国鲎抗菌肽对部分抗生素耐药菌抑菌活性测定。
[0017]图4是体外化学合成中国鲎抗菌肽对致病真菌白色念珠菌抑菌活性测定。
[0018]图5为重组中国鲎抗菌肽真核表达载体构建示意图。
[0019]图6为重组中国鲎抗菌肽PAGE凝胶电泳测定。粗提物为发酵液上清冷冻干燥浓缩而来，流穿液为亲和层析柱上样时流穿的液体，洗脱液为亲和层析纯化最后洗脱下的样品。
[0020]图7为重组中国鲎抗菌肽对大肠杆菌抑菌活性测定。A：无菌水；B：150μg/mL卡那霉素；C：0.033mg/mL 6His
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Tatritin。
[0021]图8为重组中国鲎抗菌肽对嗜水气单胞菌抑菌活性测定。A：无菌水；B：100μg/mL氨苄青霉素；C：0.033mg/mL 6His
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Tatritin。
[0022]图9为重组中国鲎抗菌肽对肺炎克雷伯菌抑菌活性测定。
具体实施方式
[0023]实施例1：中国鲎RNA的提取及cDNA的合成
[0024]1.中国鲎总RNA的提取
[0025]实验用的塑料研磨棒经0.1％DEPC水浸泡过夜，121℃30min高温高压灭菌。实验中所用各种型号EP管均为biosorfa无酶管。各试剂用无RNase的0.01％DEPC水配置。无菌注射器于中国鲎头胸甲和腹甲连接处抽取100μL血液，加入含有1mL预冷Trizol溶液的EP管中。总RNA的提取按Trizol说明书进行。提取的RNA通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见清晰的条带(图1)。总RNA样品冻存于
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中国鲎抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。2.权利要求1所述中国鲎抗菌肽的编码基因，其特征在于，所述编码基因如SEQ ID NO:2所示。3.含有中国鲎抗菌肽编码基因的表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，以毕赤酵母表达载体pGAPZαA为基础，插入的表达序列如SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：王焕岭，王伟峰，程楚星，刘红，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：