一种自养假诺卡氏菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种自养假诺卡氏菌及其应用，属于微生物技术领域。所述自养假诺卡氏菌可以用于制备骨化二醇和/或骨化三醇，相对于原始菌株，产量显著提高。产量显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种自养假诺卡氏菌及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种自养假诺卡氏菌及其应用。

技术介绍

[0002]假诺卡氏菌科是一类进化上相近、形态各异、肽聚糖含有Meso-DAP(内消旋二氨基庚二酸)、全细胞水解液中含有半乳糖和阿拉伯糖、不含枝菌酸的放线菌。该科的许多成员都能发酵产生重要的生物活性物质，包括抗生素、酶类、维生素等。同时，该科中极少有病原菌，是一类安全的微生物。
[0003]骨化二醇又称25-羟基维生素D3，作为活性维生素D3类药物的代表之一，已载入美国药典 USP36-NF31和欧洲药典(EP)8.0；临床上主要用于治疗骨紊乱、代谢性骨疾病等，尤其适合肾功能正常而肝功能丧失不全的患者使用。骨化三醇(Calcitriol)，又称1,25-二羟维生素D3，能够促进肠道对钙的吸收，提高血钙水平，可以用于甲状旁腺功能低下症，维生素D依赖性佝偻病等。研究表明，活性维生素 D3类药物及其类似物还具有调控靶细胞、诱导细胞分化及抑制细胞增殖的药效活性，有望用于恶性肿瘤、银屑病及免疫疾病等的治疗。
[0004]骨化二醇的制备有化学合成和生物发酵两种方法，化学合成反应步骤繁多、需要昂贵试剂、反应过程中会产生外消旋体，需要进行拆分，过程复杂，不仅大大影响收率，而且难以拆分完全，并且化学合成生产骨化二醇会对环境产生较大的污染。微生物发酵的方式能够利用微生物细胞内的酶特异性的解决骨化二醇的手性结构问题，其生产条件温和，收率高，成本低廉，环境友好，是一种有效替代化学合成的方法。但是现有方法中添加的底物维生素D3的浓度低，专利US5474923公开的方法中，添加维生素D3的最大浓度仅为1000ug/mL，这不利于通过增加维生素D3的投料量来提高骨化二醇的产量。
[0005]因此，仍然需要研究一种利用生物发酵法制备骨化二醇的方法，以获得具有操作简便，易于实施，收率高，纯度高，成本低，环境友好的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种自养假诺卡氏菌及其应用，具体提供一种自养假诺卡氏菌G-5H1和其应用于制备骨化二醇和/或骨化三醇的方法。
[0007]本专利技术通过对自养假诺卡氏菌，保藏号CGMCC 4.1211，名称为Pseudonocardia autotrophica的原始菌株进行基于紫外诱变和核糖体工程诱变的菌种进化，筛选获得一种新的、高产的自养假诺卡氏菌 G-5H1，其已于2020年03月09日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19461，分类命名为：Pseudonocardia autotrophica G-5H1。本专利技术还利用所获得的自养假诺卡氏菌G-5H1，建立了两相发酵法用于制备骨化二醇和/或骨化三醇，产率显著提高。
[0008]一方面，本专利技术提供一种自养假诺卡氏菌G-5H1，该菌株已于2020年03月09日保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19461，分类命名为Pseudonocardia autotrophica G-5H1。
[0009]所述自养假诺卡氏菌G-5H1是通过对保藏号为CGMCC 4.1211，名称为Pseudonocardiaautotrophica的自养假诺卡氏菌的原始菌株进行基于紫外诱变和核糖体工程诱变的菌种进化，经过筛选获得的一种菌株。
[0010]为了进行紫外诱变和/或核糖体工程诱变，可以先将自养假诺卡氏菌的原始菌株(保藏号CGMCC 4.1211，名称：Pseudonocardia autotrophica)进行培养，得到孢子悬浮液，通过稀释，计数，得出孢子浓度，得到已知孢子浓度的孢子悬浮液，如以甘油水溶液为溶剂，获得浓度为106个/ml的孢子悬浮液。将已知孢子浓度的孢子悬浮液在多种条件下进行紫外诱变和/或核糖体诱变，根据结果，得到对应的相对较有利的诱变条件。利用所获得的相对较有利的诱变条件，进行紫外诱变和核糖体工程诱变，可以得到突变菌株。获得突变菌株后，经过筛选，可以获得优选的高产菌株。
[0011]另一方面，本专利技术还提供了一种筛选包括自养假诺卡氏菌G-5H1在内的高产菌株的方法，其可以高通量筛选，得到优选的高产菌株。所述的G-5H1菌株可以通过自养假诺卡氏菌(保藏号CGMCC 4.1211，名称：Pseudonocardia autotrophica)经过紫外诱变和/或核糖体工程诱变获得的突变菌株，经过此筛选方法而获得。
[0012]一种筛选包括自养假诺卡氏菌G-5H1在内的高产菌株的方法包括：
[0013](1)将原始菌株经过紫外诱变和/或核糖体工程诱变获得的突变菌株的单菌落接种至有高氏1号培养基的孔板中，25℃-30℃恒温培养至少7天后，转接发酵培养基孔板，微孔板摇床振荡培养3-7天，优选5 天，离心收集菌体，并用PBS清洗除去培养基，然后加藜芦醇和PBS，25℃-30℃反应0.1h-2h，然后加入2,4二硝基苯肼，25℃-30℃反应10小时-16小时；然后根据颜色变化，挑选出颜色从黄色变为橙色或颜色加深的菌落，即得到潜在的高产菌株；
[0014](2)对所得的潜在的高产菌株进行摇瓶发酵：将潜在的高产菌株的单菌落分别接种至种子培养基中，在25℃-30℃恒温摇床培养48-72小时，优选60小时；然后再以种子培养基与发酵培养基的体积比计算，按照体积比5％-10％的接种量，转接于发酵培养基(如原始发酵培养基或者优化后的发酵培养基)中，在25℃
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30℃恒温摇床培养3-7天，优选4天；然后向其中加入底物维生素D3，反应1-5天，优选3天，然后用 HPLC检测分析产物，筛选出产物产量高的相应菌株；得到高产菌株。
[0015]在一些实施方式中，一种筛选包括自养假诺卡氏菌G-5H1在内的高产菌株的方法包括：
[0016](1)将原始菌株经过紫外诱变和/或核糖体工程诱变获得的突变菌株的单菌株接种至有高氏1号培养基的300μL培养基/孔的96孔板中，25℃-30℃恒温培养至少7天后，转接96孔板液体发酵培养基，每孔加入180μL-270μL发酵培养基，400rpm-600rpm微孔板摇床振荡培养3-7天，优选5天，用微孔板离心机离心收集菌体，并用PBS清洗除去培养基，然后每孔加50μL-70μL的8mmol/L-12mmol/L藜芦醇和 100μL-140μL的PBS，25℃-30℃反应0.5h-1.5h，然后加入0.1μL-10μL的0.05g/L-0.1g/L的2,4二硝基苯肼，25℃-30℃反应10小时-16小时；然后根据颜色变化，挑选出颜色从黄色变为橙色或颜色加深的菌落，即得到潜在的高产菌株；
[0017](2)对所得的潜在的高产菌株进行摇瓶发酵：将潜在的高产菌株的单菌落分别接种至种子培养基中，在25℃-30℃、220rpm-280rpm恒温摇床培养48-72小时，优选60小时；然
后再以种子培养基与发酵培养基的体积比计算，按照体积本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种自养假诺卡氏菌G-5H1，其特征在于：其于2020年03月09日保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19461，分类命名为Pseudonocardia autotrophica G-5H1。2.根据权利要求1所述的自养假诺卡氏菌G-5H1，其特征在于：所述G-5H1菌株是通过对保藏号为CGMCC 4.1211，名称为Pseudonocardia autotrophica的自养假诺卡氏菌的原始菌株进行基于紫外诱变和核糖体工程诱变的菌种进化，经过筛选获得的。3.一种发酵培养基，其组分包括或其配制所用组分包括：蔗糖，葡萄糖，玉米浆，大豆蛋白胨，酵母粉，FeSO4，MgSO4，CaCO3，NaCl，K2HPO4，NaF，吐温20和水；pH值为6.5～7.5；任选地包括β-环糊精。4.权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于，按照发酵培养基总体积计，其中，其组分或配制所用组分的浓度为：蔗糖8g/L-12g/L，葡萄糖3g/L-6g/L，玉米浆12g/L-18g/L，大豆蛋白胨30g/L-40g/L，酵母粉25g/L-35g/L，FeSO
4 0.05g/L-0.2g/L，MgSO
4 0.1g/L-1g/L，CaCO
3 1g/L-5g/L，NaCl 1g/L-10g/L，K2HPO
4 0.01g/L-0.5g/L，NaF 0.01g/L-0.5g/L和吐温20 1mL/L-10mL/L；β-环糊精为3g/L-8g/L或者为0g/L。5.权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于，按照发酵培养基总体积计，其中，其组分或配制所用组分的浓度为：蔗糖10g/L，葡萄糖5g/L，玉米浆15.37g/L，大豆蛋白胨35g/L，酵母粉31.5g/L，FeSO40.1g/L，MgSO
4 0.5g/L，CaCO
3 2g/L，NaCl 5g/L，K2HPO
4 0.1g/L，NaF0.1g/L和吐温20 5mL/L，pH值为7.0，β-环糊精浓度为0g/L或5g/L。6.权利要求1-2任一所述的自养假诺卡氏菌G-5H1或权利要求3-5任一所述的发酵培养基在制备骨化二醇和/或骨化三醇中的应用。7.一种制备骨化二醇和/或骨化三醇的方法，包括，使用权利要求1-2任一所述的自养假诺卡氏菌G-5H1和/或权利要求3-5任一所述的发酵培养基，通过两相发酵法制备；其中，所述的两相发酵法包括：(1)将权利要求1-2任一所述的自养假诺卡氏菌G-5H1接入种子培养基，摇床培养，再转接入发酵培养基中，摇床培养；(2)在发酵好的发酵培养基中维生素D3和正庚烷，任选加入β-环糊精，进行反应；反应结束后...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨虎，丰亚辉，王仲清，张克闯，林伟，罗忠华，黄芳芳，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：