转氨酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种转氨酶突变体及其应用。该转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：C60Y、F164V和第370位突变。突变体的应用可以提高反应速率，提高酶稳定性，减少了酶用量，降低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。使得其能够适合工业化生产。使得其能够适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
转氨酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]手性胺广泛存在于自然界中，是合成天然产物和手性药物的重要中间体。许多手性胺都含有一个或多个手性中心，不同手性药物的药理活性、代谢过程、代谢速率以及毒性有显著差异，通常一种对映体是有效的，而另一种对映体则是低效或无效的，甚至是有毒的。因此，如何高效立体选择性地构建含手性中心的化合物在医药研发中有着重要意义。
[0003]手性胺是合成多种生物活性化合物和活性药物成分的重要组成部分，据估计，目前40％的药物都是手性胺及其衍生物，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的合成都是以手性胺作为中间体(Top.Catal.2014,57,284
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300)，这使得手性胺化合物成为制药业的重要组成部分。
[0004]手性胺的工业生产有多种，主要依赖于烯酰胺从酮前体的金属催化氢化，过程需要昂贵的过渡金属配合物作为催化剂，由于这些过渡金属配合物资源有限，因此难以实现可持续性。同时，从酮前体经不对称合成手性胺的过程需要胺的保护和脱保护步骤，增加步骤和废物，降低收率。
[0005]催化加氢还原法合成手性胺的方法中催化剂的制备困难而且价格昂贵，设备投资大，生产成本高，对催化剂活性和加氢条件要求很高，而且催化剂有毒性，尤其是氢气中的硫化物，极易发生人员中毒。
[0006]转氨酶是以磷酸吡哆醛为辅因子，能够催化1个氨基供体(氨基酸或胺)上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺或其副产物酮或α
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酮酸的酶类的总称。由于传统的不对称合成胺的化学方法存在不同的局限性，例如低效率，低选择性和对环境污染较严重等问题，同时转氨酶催化合成手性胺具有很高的立体和化学选择性，具有安全性和环境相容性，是绿色环保的过程，被成为绿色化学。同时酶催化往往一步催化到位，具有化学方法不可比拟的优势，转氨酶合成手性化合物成为一种关键的不对称合成技术。
[0007]尽管使用转氨酶生产手性胺的进展已被高度关注，但酶促方法在放大生产应用中存在很多问题。如酶活性低及酶用量大导致发酵成本增加；同时酶活力低导致的酶用量大严重阻碍了酶催化反应的工业应用，一方面酶量大导致反应体积大，降低了催化容器的利用率。同时导致后处理时的体积增大，萃取溶剂量大，使得产品的萃取、浓缩及获得困难，产品收率低，极大的阻碍酶催化的工业应用。而活力高的酶可使酶用量降低，反应体积降低，使得酶催化的工业应用成为可能。因此获得高活的酶极为关键，同时还可扩大酶的底物谱，使得一些转化率极低甚至无活力的酶催化反应顺利进行，达到极好的转化率和极高的产品手性纯度。
[0008]另一方面，酶催化时易受反应体系中有机溶剂的影响或易受反应高pH，高温度等因素的影响而变性失活，因此增加酶对极端条件的耐受性也极为关键。工业生产手性胺，由于现有底物和氨基供体绝大部分水溶性较差，为了提高手性胺产物生成，需要增加反应体系中的有机溶剂的含量，或者使用碱性氨基供体(如异丙胺)，创造了极为苛刻的反应条件，
使得野生转氨酶极易变性丧失活力，因此需要对有机溶剂和高pH均较好耐受的转氨酶来适应工业生产的需求。

技术实现思路

[0009]本专利技术旨在提供一种转氨酶突变体及其应用，以提高转氨酶的活性。
[0010]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种转氨酶突变体。该转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第3位、第5位、第8位、第25位、第32位、第45位、第56位、第59位、第60位、第84位、第86位、第164位、第176位、第178位、第180位、第187位、第197位、第206位、第207位、第242位、第245位、第319位、第324位、第326位、第328位、第370位、第397位、第414位、第416位、第424位、第436位、第437位及第442位。
[0011]进一步地，所述转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点之一：L3S，V5S，I8A，I8S，F25L，F25T，Q32N，I45W，L59V，F56M，C60F，C60Y，F84V，W86H，W86L，W86P，W86N，F164M，F164V，F176Y，F176S，A178L，I180V，S187A，T197P，L206M，K207T，V242A，T245A，T245V，R319C，R324A，R324G，E326M，V328A，V328G，L370A，L370D，L370K，T397A，P414G，Q416A，E424D，E424T，A436S，A436G，A436P，A436N，A436Y，A436Q，A436E，M437S，M437A，R442T，R442S，R442Q和R442V；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
[0012]进一步地，C60Y+F164V、L3S+V5S、L3S+V5S+F164V、L3S+V5S+C60Y、L3S+V5S+C60Y+F164V、I180V+L370A及L3S+V5S+L59V；优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：F164V+C60Y、E424D+A436G、C60Y+F164V+A436P、C60Y+F164V+A436N、W86P+F164V、F25L+L59V、F25T+F164V、C60Y+F164V+A436Y、C60Y+F164V+A436Q、C60Y+F164V+A436E、F164V+M437A、I8A+V328A、I8S+F164V、C60Y+F164V+L370A、C60Y+F164V+L370D、C60Y+F164V+L370K、I45W+F164V、C60Y+F164V+F176Y、C60Y+F176S+F164V、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A、C60Y+F164V+R442S、C60Y+F164V+R442Q、L3S+V5S+S187A+L370A+E424D、C60Y+F164V+R442T、L3S+V5S+E424D+L370A、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+L370A、L3S+V5S+F164V+T197P+L370A、L3S+V5S+V328A+E424D、L3S+V5S+L59V+L206M+L370A、L3S+V5S+L370A+E424D、L3S+V5S+F164V+K207T+L370A、L3S+V5S+S244A+L370A、L3S+V5S+F164V+T245A+L370A、L3S+V5S+F164V+T245V+V328A、L3S+V5S+F164V+L370A+T397A、L3S+V5S+L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变的突变位点包括：C60Y、F164V和第370位突变；优选的，所述第370位突变为L370A、L370D或L370K；优选的，所述突变为C60Y+F164V+L370A、C60Y+F164V+L370D、C60Y+F164V+L370K、C60Y+F164L+I180V+L370A+G411D+A178L+S186G+S187A+Y384F+E171D+I389F+V252I+L404Q、C60Y+F164V+I180V+L370A+G411D+A178L+S186G+S187A+Y384F+E424Q、C60Y+F164V+L370A+G411D、C60Y+F164V+L370A+Y384F、C60Y+F164V+L370A+S186G、C60Y+F164V+L370A+D391E、C60Y+F164V+L370A+E171D或C60Y+F164V+L370A+L404Q。2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的转氨酶突变体。3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求2所述的DNA分子。4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET
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22a(+)、pET
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22b(+)、pET
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3a(+)、pET
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3d(+)、pET
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11a(+)、pET
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12a(+)、pET
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14b(+)、pET
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15b(+)、pET
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16b(+)、pET
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17b(+)、pET
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19b(+)、pET
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20b(+)、pET
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21a(+)、pET
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23a(+)、pET
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23b(+)、pET
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24a(+)、pET
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25b(+)、pET
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30a(+)、pET
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31b(+)、pET
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32a(+)、pET
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35b(+)、pET
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38b(+)、pET
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40b(+)、pET
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41a(+)、pET
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41b(+)、pET
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42a(+)、pET
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43a(+)、pET
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43b(+)、pET
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44a(+)、pET
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49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：凯莱英生命科学技术天津有限公司，
类型：发明
国别省市：