大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B的应用制造技术

本发明专利技术提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶(AHAS)催化亚基基因VdILV2B的应用，属于功能基因技术领域。以敲除突变体ΔVdILV2B和互补突变体为实验对象，分别从生长发育、致病力方面分析VdILV2B的作用，结果表明ΔVdILV2B菌落生长速度提高并产生更多的气生菌丝；微菌核产量显著减少；产孢量显著下降；致病力显著下降；VdILV2B也是支链氨基酸合成的必需基因，VdILV2B参与亮基酸合成。又鉴于AHAS是除草剂的作用靶点，VdILV2B可在防治棉花黄萎病中进行应用。本发明专利技术对大丽轮枝菌的防控和开发新型杀菌剂具有重要价值，对促进棉花安全生产具有重要现实意义。重要现实意义。重要现实意义。

【技术实现步骤摘要】
2010)；禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的CSU基因FgILV2敲除导致气生菌丝和红色素减少，ΔFgIlV2突变体完全丧失致病性(Liu et al.,2015)；稻瘟病菌MoIlV2亚细胞定位于线粒体上，MoIlV2基因敲除导致稻瘟菌不产生分生孢子梗和分生孢子、附着胞穿透下降和致病力显著下降(Du et al., 2013)。然而目前大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶调节亚基基因(VDAG_03688，命名为VdILV2B)的功能尚未明确。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基VdILV2B基因的新应用，明确VdILV2B基因在大丽轮枝菌的致病机制的作用，为防治大丽轮枝菌以及开发新型杀菌剂提供依据。
[0008]本专利技术提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌致病力中的应用。
[0009]优选的，所述大丽轮枝菌致病力表现在病情指数、维管束变褐程度和在寄主的定殖能力上。
[0010]本专利技术提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌亮氨酸合成中的应用。
[0011]本专利技术提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌繁殖体和/或休眠体中的应用。
[0012]优选的，所述繁殖体包括分生孢子。
[0013]优选的，所述休眠体包括微菌核。
[0014]本专利技术提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在调控大丽轮枝菌生长速度中的应用。
[0015]优选的，所述大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0016]本专利技术提供了一种用于防治棉花病害的杀菌剂，其特征在于，主要活性成分包括降低大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B表达的试剂。
[0017]优选的，所述降低大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B表达的试剂包括酰脲类除草剂和/或嘧啶水杨酸类除草剂。
[0018]本专利技术提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B作为药物靶点在防治棉花黄萎病中的应用。
[0019]本专利技术提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌致病力中的应用。本专利技术以敲除突变体ΔVdILV2B和互补突变体为实验对象，分别从病情指数、维管束变褐程度、在寄主体内定殖能力等方面分析VdILV2B基因缺失可导致大丽轮枝菌减弱维管束变褐程度，VdILV2B基因敲除使大丽轮枝菌在棉花茎中的定殖受到一定阻碍，而互补菌株与野生菌株V592在致病力方面表现一致。可见VdILV2B基因大丽轮枝菌致病力相关。
[0020]本专利技术提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌生物合成中的应用。本专利技术以敲除突变体ΔVdILV2B和互补突变体为实验对象，在营养缺陷型培养基上通过外源添加氨基酸来阐明亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸营养缺陷型培养基对菌丝
生长的影响，结果表明，5mM Leu 对V592和ΔVdILV2B敲除突变体以及互补体ECVdILV2B均有反馈抑制作用， V592相较于敲除体与互补体反馈抑制作用最强；5mM Leu抑制了VdILV2B 基因的表达，VdILV2B参与Leu的生物合成途径。同时采用磺酰脲类除草剂和嘧啶水杨酸类除草剂分别处理野生型V592，结果表明两种除草剂均明显抑制了大丽轮枝菌的生长，V592不产生微菌核，同时下调了VdILV2B基因的相对表达量，且表达量的变化呈浓度依赖性。因此，VdILV2B是支链氨基酸合成的必需基因，VdILV2B参与支链氨基酸合成。
[0021]本专利技术提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌繁殖体和休眠体产量中的应用。本专利技术以敲除突变体ΔVdILV2B和互补突变体以及野生型菌株V592为实验对象，测定不同菌株的产孢量，在接种第7d时ΔVdILV2B突变体产孢量(分生孢子)均显著低于野生型菌株 V592；而互补菌株的产孢量几乎都恢复至野生型菌菌株的水平；接种14天后测定不同菌株的微菌核的产量，VdILV2B基因敲除突变体产生的微菌核量明显低于V592菌株和互补菌株。这表明VdILV2B基因与大丽轮枝菌繁殖体产量相关。
[0022]本专利技术提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在调控大丽轮枝菌生长速度中的应用。以野生型菌株V592为对照，敲除突变体和互补体菌株在PDA培养基上的培养性状进行生长速度测定，VdILV2B基因敲除突变体的菌落生长速率显著高于V592菌株，并且产生更多的气生菌丝。
附图说明
[0023]图1为AHAS催化亚基VdILV2B基因的结构域示意图；
[0024]图2为大丽轮枝菌VdILV2B敲除突变体、互补菌株以及野生型菌株V592 的菌落形态；
[0025]图3为敲除突变体ΔVdILV2B产生的微菌核的湿重和干重结果；
[0026]图4为大丽轮枝菌VdILV2B敲除突变体产孢量测定结果；
[0027]图5为大丽轮枝菌VdILV2B敲除突变体对棉花的致病力测定结果，其中图5A为敲除突变体ΔVdILV2B
‑
1和ΔVdILV2B
‑
2及其对照菌株所致病害的棉花形态和维管束褐变形态，图5B为不同菌株处理后病情指数折线图；
[0028]图6为大丽轮枝菌VdILV2B敲除突变体对棉花的定殖情况的测定结果；
[0029]图7A为大丽轮枝菌VdILV2B敲除突变体、互补菌株以及野生型菌株在FGA培养基上接种位置示意图；
[0030]图7B为大丽轮枝菌VdILV2B敲除突变体添加不同氨基酸的FGA培养基上的菌落形态图；
[0031]图8为支链氨基酸处理后VdILV2B基因的相对表达量结果；
[0032]图9为大丽轮枝菌ΔVdILV2B基因敲除突变体中AHAS合成途径下游基因的相对表达量；
[0033]图10A为AHAS抑制剂处理V592后菌落形态变化结果；
[0034]图10B为AHAS抑制剂处理V592后VdILV2B基因的相对表达量结果
具体实施方式
[0035]本专利技术提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌致
病力中的应用。
[0036]在本专利技术中，所述VdILV2B的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板通过克隆测序得到AHAS的催化亚基基因VdILV2B。VdILV2B基因预测编码蛋白含有550个氨基酸。序列分析显示VdILV2B包含1个N
‑
末端硫胺素焦磷酸酶(TPE) 结合结构域、1个中心TPE结构域和1个C
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末端TPE结合结构域(见图1)。
[0037]为了验证VdILV2B的缺失是否会影响大丽轮枝菌致病力，本专利技术以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌致病力中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述大丽轮枝菌致病力表现在病情指数、维管束变褐程度和/或在寄主上的定殖能力上。3.大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌在亮氨酸合成中的应用。4.大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌繁殖体和/或休眠体产量中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述繁殖体包括分生孢子；所述休眠体包括微菌核。6.大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在调控大丽轮枝菌生长...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵胜楠，都业娟，黄家风，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：