一种热稳定性和催化活性提高的谷氨酰胺转氨酶变体制造技术

本发明专利技术公开了一种热稳定性和催化活性提高的谷氨酰胺转氨酶变体，属于生物领域和食品领域。本发明专利技术的谷氨酰胺转氨酶变体为热稳定性改善的酶，对SEQ ID NO:1所示序列谷氨酰胺转氨酶的第28位、96位、144位、163位、183位、208位、265位、287位、325位进行改造，并在第1位氨基酸前添加1个氨基酸，筛选得到了能够显著提升谷氨酰胺转氨酶热稳定性的变体。本发明专利技术的谷氨酰胺转氨酶变体可以在食品处理、加工和转化等方面进行应用，可以用于保持或改善食品的品质、稠度、弹性、水分或粘度，热稳定性改善的谷氨酰胺转氨酶变体更利于其在严苛的工业环境中稳定应用，如人造肉肉糜加工及肉丸加工，具备广阔的应用前景。备广阔的应用前景。备广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性和催化活性提高的谷氨酰胺转氨酶变体


[0001]本专利技术涉及一种热稳定性和催化活性提高的谷氨酰胺转氨酶变体，属于生物领域和食品领域。

技术介绍

[0002]茂源链霉菌(Streptomyces mobaraenesis DSM 40847)来源的谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,TGase,EC 2.3.2.13)是一种广泛应用于食品加工的酶。TGase可以催化蛋白及小分子中谷氨酰胺残基的γ羧酰胺基与酰基受体中氨基发生反应促使二者形成共价交联。其在食品加工领域中的应用非常广泛，包括肉类、豆制品及乳制品加工中常以添加TGase以改变食品的品相、口感和稳定性。
[0003]随着对TGase的研究及应用，发现其热稳定性差以及催化效率低是限制其实际应用的主要问题。TGase用于食品加工过程中，如加工肉丸和豆制品等，产品需要先经过高温蒸煮、并降温以使TGase发挥催化作用，而TGase介导产品交联时间多则几小时并且使用量大，因此，加入TGase使工艺更加复杂(参考专利公布号：CN109907111A、CN110495600A、CN110771811A、CN106901205B、CN109527114A)。
[0004]由于热稳定性很重要，目前改造酶热稳定性方法主要为理性设计和定向进化。理性设计即通过机器模拟方式，确定酶结构中不稳定的区域，并引入氨基酸突变以提升酶的稳定性。定向进化包括基于宿主细胞的定向进化和基于酶基因的定向进化，前者通过物理、化学等方式对宿主细胞进行诱变，以获得需要的酶性状，后者主要对酶基因进行随机突变、同源蛋白基因重组以获得定向进化。目前针对TGase进行热稳定性提升的相关报道有如下：(1)通过随机突变获得高稳定型TGase突变点(DOI:10.1016/j.jbiotec.2008.06.005)；(2)对(1)中所获得的单点突变，进行位点饱和突变，以及DNA重组，获得高稳定TGase组合突变体(DOI10.1007/s00726
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011
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1015
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y)；(3)在(1)、(2)的所筛选到的突变点基础上进行进一步组合突变(DOI:10.1080/09168451.2017.1403881)。然而，目前报道中的高稳定型TGase突变体，经水浴条件下60℃孵育较金属浴条件下孵育后稳定差，尚有较大的改良空间。在实际应用过程中，如肉糜、玉米粉、豆制品加工等，TGase混入后处理温度通常为40
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50℃，反应时间较长。并且，在应用TGase前常伴随着整个体系的预冷，而TGase在60℃条件下稳定性极差，导致加入量高和利用率低的问题。所以，设计改造获得高稳定型TGase在满足工业应用中尤为重要。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术提供了热稳定性改善的谷氨酰胺转氨酶变体。
[0006]本专利技术的谷氨酰胺转氨酶变体，所述变体包含对应于SEQ ID NO:1所示的多肽的第28位、第96位、第144位、第163位、第183位、第208位、第265位、第287位和第325位的取代，同时在SEQ ID NO:1所示的多肽的第1位氨基酸前(即
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1位)添加天冬酰胺；其中，
[0007]i)所述谷氨酰胺转氨酶变体与SEQ ID NO:1所示的第28位、第96位、第144位、第
163位、第183位、第208位、第265位、第287位和第325位的取代的多肽的具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；和/或
[0008]ii)所述谷氨酰胺转氨酶变体的成熟区是由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:3所示的核苷酸1位至993位的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性；
[0009]其中，所述谷氨酰胺转氨酶变体经中性蛋白酶处理后，获得具有活性的酶。
[0010]在一种实施方式中，所述序列SEQ ID NO:1谷氨酰胺转氨酶的第28位的取代，取代成苏氨酸(T)；第96位的取代，取代成谷氨酸(E)；第144位的取代，取代成天冬氨酸(D)；第163位的取代，取代成天冬氨酸(D)；第183位的取代，取代成谷氨酸(E)；第208位的取代，取代成谷氨酸(E)；第265位的取代，取代成脯氨酸(P)；第287位；取代成脯氨酸(P)；第325位的取代，取代成谷氨酸(E)；第1位前添加1个氨基酸(即生成
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1位氨基酸)，添加氨基酸为天冬酰胺(D)。
[0011]在一种实施方式中，所述谷氨酰胺转氨酶变体命名为D
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E28T
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N96E
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S144D
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N163D
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R183E
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R208E
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A265P
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A287P
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K325E。
[0012]在一种实施方式中，所获得序列如SEQ ID NO:2所示。
[0013]本专利技术提供了编码所述变体的多核苷酸。
[0014]本专利技术提供了包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞。
[0015]本专利技术提供了产生所述变体或其成熟酶的方法。
[0016]本专利技术提供了包含本专利技术的谷氨酰胺转氨酶变体或其成熟酶的组合物。
[0017]本专利技术还提供了产生本专利技术的谷氨酰胺转氨酶变体或其成熟酶的方法，这些方法包括：
[0018]a)在适合于表达所述变体的条件下培养本专利技术的宿主细胞；以及
[0019]b)任选地回收所述变体。
[0020]本专利技术提供了所述变体及其成熟酶在食品、生物医药、组织工程、纺织和皮革领域中的应用。
[0021]在一种实施方式中，所述食品领域包括但不限于在乳制品、肉制品、豆制品中的应用。
[0022]在一种实施方式中，所述乳制品包括热加工熟肉制品、发酵肉制品、预制调理肉制品、腌腊肉制品、肉糜制品、肠类制品；所述乳制品包括液体乳、乳粉、酸奶、奶酪、冰淇淋及其他乳制品；所述豆制品包括但不限于豆腐、豆腐干、豆腐皮。
[0023]本专利技术提供了在鲜肉加工、肠类制作、鱼丸加工、肉糜加工、豆制品和/或乳制品中改变食品品相、口感和/或稳定性的方法，所述方法包括在上述食品加工过程中添加本专利技术所述的谷氨酰胺转氨酶变体或本专利技术所述的组合物进行处理。
[0024]本专利技术还涉及所述的谷氨酰胺转氨酶变体或其成熟酶或本专利技术所述的组合物在食品处理、加工和转化方面的应用。
[0025]在一种实施方式中，用于保持或改善食品的品质、稠度、弹性、水分或粘度。
[0026]在一种实施方式中，其中所述食品选自奶酪、酸乳、冰淇淋、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.谷氨酰胺转氨酶变体，其特征在于，所述变体包含对应于SEQ ID NO:1所示的多肽的第28位、第96位、第144位、第163位、第183位、第208位、第265位、第287位和/或第325位的取代，并同时在SEQ ID NO:1所示的多肽的第1位氨基酸前添加天冬酰胺；其中，i)所述谷氨酰胺转氨酶变体与SEQ ID NO:1所示的第1到331位的多肽的具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；和/或ii)所述谷氨酰胺转氨酶变体的成熟区是由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:3所示的核苷酸1位至993位的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。2.根据权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶变体，其特征在于，所述第28位的取代是用苏氨酸取代谷氨酸；所述第96位的取代是用谷氨酸取代天冬酰胺；所述第144位的取代是用天冬氨酸取代丝氨酸；所述第163位的取代是用天冬氨酸取代天冬酰胺；所述第183位的取代是用谷氨酸取代精氨酸；所述第208位的取代是用谷...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘松，王兴隆，杜建辉，周景文，陈坚，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：