一种丙环唑半抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种丙环唑半抗原及其制备方法和应用。丙环唑半抗原采用从头合成法，在丙环唑的苯环上连接含有4个C原子的连接臂，并在连接臂末端引入可以和载体蛋白偶联的羧基基团。利用该半抗原制备的单克隆抗体灵敏度高，特异性强。用间接竞争酶联免疫测定(ic

【技术实现步骤摘要】
一种丙环唑半抗原及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种丙环唑半抗原及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]丙环唑是一种兼具保护和治疗作用的内吸性三唑类杀菌剂，它被广泛用于防治谷类、蔬菜、水果上白粉菌、锈菌、炭疽病菌等真菌的危害。其作用机理是通过影响真菌麦角甾醇的生物合成和抑制真菌类固醇的代谢从而抑制真菌的生长发育。此外，丙环唑作为一种植物生长调节剂具有较好的控旺压苗作用，常被用于控制菜心、普通白菜、芥蓝等叶菜的外形，促进茎叶粗壮和叶色深绿，增加产量。
[0003]丙环唑的广泛应用引发了人类对其是否会产生健康危害的思考。许多研究报道了丙环唑的过量施用损伤实验动物的肝脏功能，影响神经行为，内分泌调节及细胞增殖。因此，丙环唑的不合理使用引起食品中农药残留的超标严重影响人类的身体健康。
[0004]我国于2021年在国标中规定，丙环唑在农产品上最低的最大残留限量为0.02mg/kg(菠萝，甘蔗，黑麦等)。2005年，欧盟规定了农产品中丙环唑最低的最大残留限量为0.05mg/kg(叶菜类等)。因此，为了保障食品安全及对外贸易的发展，建立灵敏、准确、方便、省时的丙环唑检测方法是非常必要的。
[0005]当前，丙环唑的测定方法主要为仪器检测法，包括气相色谱法、气相色谱
‑
串联质谱法、液相色谱法及液相色谱
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串联质谱法等。仪器检测法虽然具有高精密度和准确度的优点，但是仪器价格昂贵，需要专业技术性人员操作等缺点使其不能被广泛应用。免疫检测法对仪器设备及专业人员的要求低，适用于大量样品的检测，能够克服仪器检测法的不足。目前，用于免疫检测的抗体主要为多克隆抗体和单克隆抗体，其中单克隆抗体因批次差异小、可大量制备等优点，是建立免疫检测方法和开发免疫检测产品的首选抗体。酶联免疫免疫吸附分析(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)和胶体金试纸条是常用的免疫检测方法，ELISA具有灵敏度高、准确性好、成本低等优点，且可对大量样品进行高通量的定量检测；试纸条具有操作简便、快速、经济等优点，且检测结果呈现直观。然而，免疫检测法的灵敏度、特异性取决于抗体的质量，而半抗原的结构决定了是否能够获得高质量的抗体。因此，半抗原的结构对于免疫方法的建立起着决定性的作用。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种丙环唑半抗原及其制备和应用。
[0007]第一方面，该专利技术设计的丙环唑半抗原结构式如式I。
[0008][0009]第二方面，本专利技术提供了一种上述丙环唑半抗原的制备方法，其制备步骤如下：
[0010]步骤1)1.52g N
‑
溴代琥珀酰亚胺与2g 2
‑
氯
‑4‑
溴
‑
苯乙酮加入12mL乙腈中，在12℃的条件下搅拌反应10分钟。随后2.95g对甲苯磺酸加入上述混合液中，并在15
‑
80℃的条件下搅拌反应1.17小时。反应得到的产物通过硅胶柱纯化，用体积比为100∶1到10∶1的石油醚
‑
乙酸乙酯洗脱分离，得产物1。
[0011][0012]步骤2)4g产物1与2g 1，2
‑
戊二醇加入24mL甲苯中，然后加入12mL正丁醇和1.1g对甲苯磺酸，上述混合物在135℃下搅拌反应15h。反应结束后其产物通过硅胶柱纯化，用体积比为100∶1到10∶1的石油醚
‑
乙酸乙酯洗脱分离，得产物2。
[0013][0014]步骤3)1.39g KOH和0.73g 1H
‑
1，2，4
‑
苯三唑溶于14mL DMSO中，将2.8g产物2在45℃条件下加入上述混合物中，该混合物在135℃搅拌反应15h。反应得到的产物通过硅胶柱纯化，用体积比为100∶1到10∶1的石油醚
‑
乙酸乙酯洗脱分离，得产物3。
[0015][0016]步骤4)1.77g产物3溶于7.5mL四氢呋喃中，5.56g三乙胺和0.16g双(三苯基膦)氯化钯(II)加入上述溶液。随后0.087g CuI也加入上述溶液中(在CuI加入前后需用氮气净化混合溶液三次)。然后1.03g 4
‑
戊炔酸甲酯加入到混合溶液中并用氮气净化三次。15℃搅拌10min后，0.087g CuI加入到混合溶液中并于75℃条件下持续搅拌12h。反应结束后，产物通过硅胶柱纯化，用体积比为50∶1到1∶1的石油醚
‑
乙酸乙酯洗脱分离，得产物4。
[0017][0018]步骤5)1.77g产物4和0.096g二氧化铂加入20mL乙酸乙酯中，用氢气净化三次后，上述混合物在30℃，氢气压强50psi条件下搅拌反应6h。反应结束后产物通过硅胶柱纯化，用体积比为100∶1到10∶1的石油醚
‑
乙酸乙酯洗脱分离，得产物5。
[0019][0020]步骤6)1.2g产物5与0.12g单水氢氧化锂加入6.5mL四氢呋喃并于15
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25℃条件下搅拌反应15h。反应结束后产物通过硅胶柱纯化，用体积比为100∶1到10∶1的石油醚
‑
乙酸乙酯洗脱分离，获得无色油状的丙环唑半抗原。
[0021][0022]第三方面，本专利技术提供了一种丙环唑人工抗原，其通过上述的丙环唑半抗原与载体蛋白偶联获得。丙环唑人工抗原包括丙环唑免疫原和包被原，丙环唑免疫原是丙环唑半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联获得，丙环唑包被原是丙环唑半抗原与鸡卵白蛋白(OVA)偶联制得。
[0023]丙环唑人工抗原的制备包括如下步骤：
[0024]步骤1)半抗原的活化。取0.082g如权利要求1所述丙环唑半抗原溶于1.5mL N，N
‑
二甲基甲酰胺中，向上述溶液中加入0.023g N
‑
羟基琥珀酰亚胺后，室温下搅拌15分钟，随后向混合物中加入1mL含0.041g N，N
‑
二环己基碳二亚胺的N，N
‑
二甲基甲酰胺溶液，搅拌反应过夜。
[0025]步骤2)半抗原与载体蛋白的偶联。将步骤1反应后的产物4000rpm离心5分钟，取上清1.25mL缓慢滴加到5mL 10mg/mL牛血清白蛋白的磷酸缓冲液(0.01mol/L，pH＝8)中，室温下避光搅拌反应4h后得到丙环唑免疫抗原；另取步骤1离心后的产物1.25mL缓慢滴加到5mL 10mg/mL鸡卵白蛋白的磷酸缓冲液(0.01mol/L，pH＝8)中，室温下避光搅拌反应4h即得到丙环唑包被抗原。
[0026]步骤3)人工抗原的纯化。将步骤2得到的丙环唑免疫抗原和丙环唑包被抗原用0.01mol/L PBS缓冲液透析纯化3天，取出后4000rpm离心5min，取上清测浓度并分装冻存。
[0027]第五方面，本专利技术提供了一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体特异性识别上述的
丙环唑半抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种丙环唑半抗原，其特征在于，其分子结构式如下式I所示：2.一种制备如权利要求1所述的丙环唑半抗原的制备方法，其制备步骤如下：步骤1)1.52g N
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溴代琥珀酰亚胺与2g 2
‑
氯
‑4‑
溴
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苯乙酮加入12mL乙腈中，在12℃的条件下搅拌反应10分钟；随后2.95g对甲苯磺酸加入上述混合液中，并在15
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80℃的条件下搅拌反应1.17小时；反应得到的产物通过硅胶柱纯化，用体积比为100∶1到10∶1的石油醚
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乙酸乙酯洗脱分离，得产物1，步骤2)4g产物1与2g 1，2
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戊二醇加入24mL甲苯中，然后加入12mL正丁醇和1.1g对甲苯磺酸，上述混合物在135℃下搅拌反应15h；反应结束后其产物通过硅胶柱纯化，用体积比为100∶1到10∶1的石油醚
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乙酸乙酯洗脱分离，得产物2，步骤3)1.39g KOH和0.73g 1H
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1，2，4
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苯三唑溶于14mL DMSO中，将2.8g产物2在45℃条件下加入上述混合物中，该混合物在135℃搅拌反应15h；反应得到的产物通过硅胶柱纯化，用体积比为100∶1到10∶1的石油醚
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乙酸乙酯洗脱分离，得产物3，步骤4)1.77g产物3溶于7.5mL四氢呋喃中，5.56g三乙胺和0.16g双(三苯基膦)氯化钯加入上述溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：华修德，王鸣华，李姣，丁园，陈贺，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：