一种敲减PKR的Marc-145细胞系制造技术

本发明专利技术属于分子生物学和细胞生物学领域，具体涉及一种PKR基因敲减Marc

【技术实现步骤摘要】
一种敲减PKR的Marc
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145细胞系


[0001]本专利技术属于分子生物学和细胞生物学领域，具体涉及一种PKR基因敲减Marc
‑
145细胞系。

技术介绍

[0002]干扰素诱导的双链RNA激活的蛋白激酶（interferon
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induced, double
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stranded（ds）RNA
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activated kinase，PKR）是一种丝氨酸
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苏氨酸激酶，它能够被细胞、病毒的双链RNA（dsRNA）或合成类似物（例如polyI：C）激活，在宿主抗病毒防御过程中发挥重要作用。其抗病毒活性主要通过单体PKR与病毒复制过程中产生的双链RNA（dsRNA）结合，形成二聚体并发生自身磷酸化，之后催化其底物
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真核生物翻译起始因子2α（alpha subunit of the eukaryotic initiation factore，eIF2α）磷酸化，导致病毒蛋白的合成受到抑制，从而产生抗病毒作用。
[0003]有研究表明
[1]，以siRNA转染下调Hela细胞PKR的表达能够促进鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）的增殖，转染重组质粒上调PKR的表达，NDV的增殖受到明显的抑制。
[0004]Xiao Y等
[2]研究揭示，PRRSV在感染猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophage，PAM）早期通过抑制PKR活性从而促进自身的增殖。Marc
‑
145细胞是支持猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）体外复制增殖的重要细胞系，克隆自MA
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104细胞系，是源于长尾黑颚猴（Cercopithecus aethiops）的一种肾细胞系。Wang X等
[3]研究PRRSV在Macr
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145细胞感染研究时，病毒感染12~24 h能够短暂的活化PKR，并且在病毒感染前，细胞转染PKR基因小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），与对照相比，PRRSV基因转录、蛋白合成、增殖滴度均降低，说明PKR促进了PRRSV在Marc
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145细胞的增殖，但没有进行细胞系构建并开展相关研究。可见，PRRSV在天然宿主细胞PAM及体外培养初代细胞Marc
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145增殖过程中，PKR发挥了不尽相同的作用。
[0005]猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染宿主细胞范围比较广，有研究揭示
[4]，当PRV感染MDBK（牛肾细胞）时，PKR与PKR样内质网激酶（PKR
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like ER kinase，PERK）的表达均下降，以PKR抑制剂2
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氨基嘌呤处理病毒感染的细胞，蛋白表达能够部分恢复； Xu S等
[5]研究揭示，PRV感染PK
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15细胞时，在感染早期PKR被活化，感染晚期其活性受到PRV蛋白的抑制，并且在感染早期，PRV感染Vero细胞时能够抑制eIF2α的磷酸化，然后促进自身的增殖，而eIF2α的磷酸化是由PRV感染后活化的PERK介导的。可见，PKR理论上对PRV的增殖有可能产生抑制作用。
[0006]参考文献：[1] Zhang S, Sun Y, Chen H, Dai Y, Zhan Y, Yu S, Qiu X, Tan L, Song C, Ding C. Activation of the PKR/eIF2α signaling cascade inhibits replication of Newcastle disease virus. Virol J. 2014 Mar 31;11:62.
[2] Xiao Y, Ma Z, Wang R, Yang L, Nan Y, Zhang YJ. Downregulation of protein kinase PKR activation by porcine reproductive and respiratory syndrome virus at its early stage infection. Vet Microbiol. 2016 May 1;187:1
‑
7.[3] Wang X, Zhang H, Abel AM, Nelson E. Protein kinase R (PKR) plays a pro
‑
viral role in porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) replication by modulating viral gene transcription. Arch Virol. 2016 Feb;161(2):327
‑
33.[4] Wong ML, Yen YR. Protein synthesis in pseudorabies virus
‑
infected cells: decreased expression of protein kinase PKR, and effects of 2
‑
aminopurine and adenine. Virus Res. 1998 Aug;56(2):199
‑
206.[5] Xu S, Chen D, Chen D, Hu Q, Zhou L, Ge X, Han J, Guo X, Yang H. Pseudorabies virus infection inhibits stress granules formation via dephosphorylating eIF2α. Vet Microbiol. 2020 Aug;247:108786。

技术实现思路

[0007]针对现有技术中的问题，本专利技术提供一种PKR基因敲减的Marc
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145细胞系，能够促进新城疫病毒（NDV）增殖的同时抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪伪狂犬病毒（PRV）增殖。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
[0009]一种敲减PKR基因的siRNA，其正向和反向核苷酸序列如SEQ ID NO:1
‑
2所示。
[0010]一种敲减PKR基因的shRNA，其模板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0011]一种包含如SEQ ID NO:1
‑
2或SEQ ID NO:3所示目的基因序列的表达载体。所述表达载体是病毒、真菌或细菌表达载体。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种敲减PKR基因的siRNA，其正向和反向核苷酸序列如SEQ ID NO:1
‑
2所示。2. 一种敲减PKR基因的shRNA，其模板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。3. 一种包含如SEQ ID NO:1
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2或SEQ ID NO:3所示目的基因序列的表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，表达载体选自病毒、真菌或细菌表达载体。5.一种包含权利要求3或4所述表达载体的细胞。6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自家禽或哺乳动物细胞系。7.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自鸡胚细胞、HEK293细胞、Marc
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145细胞或Vero细胞。8. 一种敲减PKR的Marc
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖跃强，杨慧，王文秀，魏凤，唐娜，李峰，沈志强，
申请(专利权)人：山东省滨州畜牧兽医研究院，
类型：发明
国别省市：