一种基于靶点内回文序列介导的MMEJ靶向基因组修饰方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种基于靶点内回文序列介导的MMEJ靶向基因组修饰方法和应用。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9系统借助内外源同一靶点反向互补后形成6bp的微同源序列可对鱼类基因进行内源修饰标记。以斑马鱼为例，申请人对斑马鱼心脏特异表达的基因myl7进行基因组靶向修饰，建立斑马鱼心脏特异标记绿色荧光蛋白的转基因品系。基于靶点内回文序列介导的MMEJ靶向基因组修饰是一种精准高效的修复方式，在不破坏内源基因功能的前提下实现组织特异性标记，并真实准确灵敏地反应基因myl7的分子表达水平，更进一步的有助于促进myl7基因功能的研究。myl7基因功能的研究。

【技术实现步骤摘要】
一种基于靶点内回文序列介导的MMEJ靶向基因组修饰方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于靶点内回文序列介导的MMEJ靶向基因组修饰方法和应用。

技术介绍

[0002]基因组的精细编辑是实现基因组复杂精细靶向修饰的关键技术，该技术能够在基因组中定点插入人为设计的DNA片段，这个DNA片段可以是编码功能蛋白的单个或多个DNA分子，可以是具有转录活性的调控元件或者是具有调控活性的基因组序列，因此靶向基因组修饰方法是一种实现基因“定点整合、可控表达”的关键技术。
[0003]近年来，随着各种靶向核酸酶介导的基因组编辑技术在生物基因组领域中的飞速发展，其中，CRISPR(clustered regularly interspersed short palindromic repeats)/Cas9系统组分较为简单且具有更高的效率，成为当前最常用的靶向核酸酶。有研究者尝试利用靶向核酸酶诱导的宿主DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)，结合多种DSBs的修复机制，在模式动物斑马鱼中初步实现了定点整合。例如北京大学张博团队率先利用靶向核酸酶介导的同源重组(Homologous Recombination,HR)在斑马鱼中实现精确的整合，但传代的效率较低仅有1.5％，因此利用HR进行定点整合仅仅局限在有限的基因组靶位实现，这项技术也没能被领域内广泛接受和应用。与此同时，许多研究团队通过调整同源臂的长度或者质粒的线性化等方式进行靶向整合，尽管这些研究报道了在不同靶位上实现了基因的敲入，但在他们的研究中都有共同的问题未能完全克服，即传代效率和精确整合效率较低。2015年，中国科学院上海生命科学研究院杜久林团队巧妙地将DSBs的断裂位置设计在靶基因最后一个内含子上，利用DSBs的非同源末端连接(nonhomologous end
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joining,NHEJ)机制实现了在不破坏内源基因表达的情况下成功引入外源基因，并且传代的效率也达到了12％，此方法为基因敲入技术的建立提供了新的思路。更进一步的，他们利用该设计思路在最近的研究中将基因敲入的效率提升到了28％(2/7)。但是，由于内含子常常含有大量的重复序列，不利于设计gRNA靶点，同时NHEJ导致的DNA序列随机丢失往往导致目的基因的整合和表达不尽如人意。因此，无论是基于HR还是基于NHEJ机制的鱼类基因组定点敲入技术都存在靶点选择、载体构建和敲入效率等各方面的问题。
[0004]近年，申请人和哈佛医学院Alexander Schier教授实验室的研究先后发现，微同源介导末端连接(microhomology mediated end joining，MMEJ)是在鱼类早期发育过程中DSBs的主要修复方式。随后，利用MMEJ机制在斑马鱼胚胎中实现精确整合有发现，在NHEJ介导外源基因敲入效率高达56％的情况下，通过在靶点附近引入不同长度的同源片段(10
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40bp)能够促进外源基因精确整合的效率，可以提升到60％
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77％。但是，受限于前述报道中载体DSBs产生的方式，这些报道中的方法应用范围局限性较大。
[0005]荧光标记蛋白的活体成像是了解基因功能的重要工具，最准确的再现生理基因表达水平和模式的方法是直接在其内源性基因组位点标记该基因，产生相应的融合蛋白，而
实现这一特异性标记的关键性技术即为靶向核酸酶介导的基因敲入技术。尽管利用CRISPR/Cas9系统在许多模式生物中使得基因敲入技术成为可能，在斑马鱼中也实现了多个基因座位的基因敲入，但是所报道的方法在敲入效率、精确性和普适性方面仍具有一定的局限性，到目前为止，这些报道中的策略无法应用到所有的基因组靶位。因此，亟需寻求建立一种高效精确普适的基因敲入技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供了一种基于靶点内回文序列介导的MMEJ靶向基因组修饰的制备方法，该修饰具体为定点基因敲入。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供了一种基于靶点内回文序列介导的MMEJ靶向基因组修饰的方法在鱼类基因敲入中的应用。
[0008]为了实现上述的目的，本专利技术采用了以下技术措施：
[0009]一种基于靶点内回文序列介导的MMEJ靶向基因组修饰的方法，包括下述步骤：
[0010]1)选择目的基因中含有回文序列的靶序列为gRNA；所述的回文序列为CCNMGG，NM代表AT，TA，CG或GC；
[0011]2)扩增目的敲入基因，所述的基因的5
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端带有步骤1)中的gRNA的反向互补序列；扩增完毕后构建携带有外源基因的基因敲入载体；
[0012]3)将gRNA、基因敲入载体、Cas9 mRNA显微注射至鱼类1细胞期的胚胎。
[0013]以上所述的步骤中，优选的，选择gRNA后先进行靶点有效性的验证，即利用CRISPR/Cas9系统对合成的靶点借助显微注射的方法在斑马鱼1细胞期注射，注射组分为Cas9 mRNA和gRNA，注射后的胚胎发育后提取基因组，进行测序验证所设计靶点的有效性。
[0014]上述的方法，可用于鱼类基因敲入或是鱼类基因内源标记。
[0015]以上所述的步骤中，优选的，选择斑马鱼myl7基因的CCGCGGCCAAGAGGGGGAAAACT为gRNA，最终构建基因敲入载体pGT
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myl7(SEQ ID NO.1所示)，将pGT
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myl7质粒、Cas9 mRNA、靶点gRNA和酚红混合利用显微注射的方法把样品注射到1细胞期的斑马鱼胚胎中，即可筛选获得目标产物。
[0016]以上所述的步骤中，优选的，所述的外源基因为外源修饰基因，优选为荧光标记基因，包括但不限于绿色荧光蛋白基因，红色荧光蛋白基因，蓝色荧光蛋白基因等。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和效果：
[0018]本专利技术的将内源靶点反向互补后作为外源载体的靶点，经CRISPR/Cas9系统切割后内外源切割末端会形成6bp的微同源序列，借助该微同源序列利用MMEJ修复DSBs的机制可以对内源基因实现精确靶向修饰，成功引入外源载体序列，完成对内源基因的荧光或Tag标记。该设计实现了内源高效靶点即为外源载体靶点，6bp的微同源介导的DNA连接方式既具有HR介导基因敲入的精确性又具有高于NHEJ介导基因敲入的高效性，并且MMEJ外源载体的构建远比HR外源载体的构建方便快捷，也不像HR一样受限于内源基因组中广泛存在的单碱基多态性的干扰。因此，利用MMEJ介导的DNA修复机制在鱼类建立精准高效的基因敲入技术具有明显优势。
[0019]利用该策略外源载体设计较为简单，并且在P0代即可以观察到非常特异的荧光蛋白表达，具有较高的敲入效率。
附图说明
[0020]图1为靶点在基因组位置的示意图；
[0021]其中，所设计的靶点(CCGCGGCCAAGAGGGGGAAAACT，PAM)位于m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于靶点内回文序列介导的MMEJ靶向基因组修饰的方法，包括下述步骤：1）基于CRISPR/Cas9系统对前间区序列邻近基序区序列特异性的要求，选择目的基因中含有回文序列的靶序列为gRNA; 所述的回文序列为Cas9蛋白切割位点上游6bpCCNMGG，NM代表AT，TA，CG或GC；2）扩增目的敲入基因，所述的基因的5
’
端带有步骤1）中的gRNA的反向互补序列；扩增完毕后构建携带有外源基因的基因敲入载体；3）将gRNA、基因敲入载体、Cas9 mRNA显微注射至鱼类1细胞期的胚胎。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：选择gRNA后先进行靶点有效性的验证，即利用CRISPR/Cas9系统对合成的靶点借助显微注射的方法在斑马鱼1细胞期注射，注射组分为Cas9 mRNA ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王厚鹏，孙永华，何牡丹，叶鼎，王小四，
申请(专利权)人：权利要求书一页说明书六页序列表五页附图二页，
类型：发明
国别省市：