本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体提供了一株高产酸性乳糖酶的黑曲霉菌株。申请人首先将来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的酸性乳糖酶基因在黑曲霉（Aspergillus niger）宿主中过表达，构建得到高效表达酸性乳糖酶的黑曲霉工程菌，然后进一步通过紫外诱变方法筛选获得一株酸性乳糖酶产量显著提高的突变菌株，保藏编号为CGMCC No.19280，可广泛应用于酸性乳糖酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。有利于降低该酶的生产成本。
【技术实现步骤摘要】
一株高产酸性乳糖酶的黑曲霉菌株
[0001]本专利技术属于基因工程和微生物改造
，具体内容涉及一株高产酸性乳糖酶的黑曲霉突变菌株。
技术背景
[0002]乳糖酶能水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖，还可以通过半乳糖苷转移作用生成功能性低聚半乳糖，又称β-D-半乳糖苷酶（β-D-galactoside-galactohydrolase E.C.3.2.1.23）。通常在乳制品行业中用来降低乳制品中乳糖含量，解决乳糖不耐症；除了水解乳糖外，乳糖酶还具有转苷能力，可以利用乳糖合成低聚半乳糖。乳糖酶在自然界中广泛存在，不仅存在于细菌、真菌、霉菌等常见微生物中，而且在动物的皮肤和肠道组织、植物的叶茎种子也广泛存在。其中，对微生物来源的乳糖酶研究最为广泛。
[0003]不同来源的乳糖酶性质各异，正是这种性质的多样性大大提高了其在食品工业的应用。目前，商品化的乳糖酶主要来源于微生物。以大肠杆菌（Escherichia coli）、黑曲霉（Aspergillus niger）、乳糖发酵酵母（Kluyveromyces lactis）以及臭曲霉（A.foetidus）的变异株为适宜。其中，作为食品安全菌的曲霉以及克鲁维酵母属来源的乳糖酶的研究最为广泛。例如，Frezel等比较了米曲霉、棘孢曲霉以及克鲁维乳酸菌来源的乳糖酶的转苷能力。除了具有食品安全菌的优良特性外，反应pH偏酸性也是真菌来源乳糖酶的优势。例如，Kluyveromyces fragilis和A. niger来源的乳糖酶最适pH为4.0-4.5，并且在pH 3.0-7.0之间稳定性都比较好，最适温度为55℃，比较适用于酸性乳酪中乳糖的水解。Isobe等从温泉中分离出Teratosphaeria acidotherma AIU BGA-1，发现其来源的乳糖酶能够在酸性到中性pH范围内均保持很高的活性。
[0004]目前，细菌来源的乳糖酶很少被应用于生产低聚半乳糖，但随着越来越多的基因被挖掘，其生产低聚半乳糖的优势也逐渐体现出来。例如，很多嗜冷菌、嗜热菌等从极端环境分离的菌株来源的乳糖酶往往具有特殊的优良性质。Goodman等对嗜热脂肪芽杆菌（Bacillus stearothermophilus AT-3）来源的乳糖酶进行了克隆表达，其最适作用温度为65℃，最适pH 为6.0-6.4。除了嗜热嗜冷菌外，乳酸菌来源的乳糖酶也受到广泛研究。乳酸菌作为益生菌，在食品生产中具有重要应用价值。因此，目前对乳酸菌来源的乳糖酶研究也比较多。
[0005]食物进入消化道后，在消化过程中需要经过不同的pH过程，从pH 1.8-5.5的大范围变化，在胃里还要忍受胃蛋白酶的降解作用。因此，为了能够在消化道中更加有效的水解奶制品中的乳糖，理想中的乳糖酶应具有耐酸、抗蛋白酶的特性，还要在生理温度和低pH具有高活性。
[0006]但目前常用的乳糖酶生产菌株的产量普遍偏低，导致乳糖酶的成本居高不下，严重限制了其在食品等工业领域的广泛应用。因此，现在急需开发一种乳糖酶产量高且乳糖酶性质优异的生产菌种。
技术实现思路
[0007]本专利技术为解决现有技术问题，提供了一株高产酸性乳糖酶的黑曲霉菌株。申请人首先将来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的酸性乳糖酶基因在黑曲霉（Aspergillus niger）宿主中过表达，构建得到高效表达酸性乳糖酶的黑曲霉工程菌，然后进一步通过紫外诱变方法筛选获得一株酸性乳糖酶产量显著提高的突变菌株，可广泛应用于酸性乳糖酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。
[0008]本专利技术一方面提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有酸性乳糖酶基因。
[0009]所述酸性乳糖酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0010]本专利技术一方面提供了一种黑曲霉工程菌株，所述菌株携带有上述重组质粒。
[0011]本专利技术还提供了一种突变菌株黑曲霉Su-ZN25（Aspergillus niger Su-ZN25），是以上述的黑曲霉工程菌为出发菌株通过紫外诱变获得的。
[0012]所述突变菌株已于2020年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 19280。
[0013]本专利技术将来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的酸性乳糖酶基因在黑曲霉宿主中过表达，构建得到重组表达酸性乳糖酶的工程菌株黑曲霉Su-ZN1。该菌株摇瓶发酵上清液中酸性乳糖酶酶活达到386U/ml，30L罐发酵酶活达到1393u/ml。
[0014]为了提高酸性乳糖酶的产量，申请人以黑曲霉Su-ZN1为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌株黑曲霉Su-ZN25。该突变菌株能大幅度提高酸性乳糖酶的产量，其摇瓶发酵上清液中酸性乳糖酶酶活达到799u/ml，30L罐发酵酶活达到2640u/ml，比出发菌分别提高了107%和89.5%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于酸性乳糖酶的生产，从而有利于降低该酶的生产成本。
[0015]所述突变菌株生产的酸性乳糖酶最适作用pH值为4.5，在pH3.5-5.5之间能保持80%以上的酶活水平；最适作用温度为55℃，在45-55℃之间能保持70%以上的酶活水平；在60℃条件下处理3min后，酶活残留率为93%，65℃条件下处理3min后，酶活残留率为58%，具有较强的耐热性，可广泛应用于食品加工等领域。
附图说明
[0016]图1为质粒pGAU图谱；图2为30L罐发酵曲线图；图3为pH-相对酶活曲线图；图4为温度-相对酶活曲线图。
具体实施方式
[0017]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记
载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。
[0018]下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细描述。
[0019]实施例1酸性乳糖酶基因的获得申请人将来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的酸性乳糖酶基因命名为ZN，其核苷酸序列为为SEQ ID NO：1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。申请人优化了合成基因的密码子并人工合成该基因。
[0020]PCR引物和反应条件如下：引物1（F）：ATGAAGCTGCTCAGCGTCGCC引物2（R）：TTAGTAAGCGCCCTTACGCTG反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有酸性乳糖酶基因。2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述酸性乳糖酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。3.一种黑曲霉工程菌株，其特征在于，所述工程菌株携带有权利要求1或2所述的重组质粒。4.一种黑曲霉突变菌株，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓东，陆娜，吴佳鹏，张金祥，
申请(专利权)人：权利要求书一页说明书六页序列表五页附图二页，
类型：发明
国别省市：
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