一种CuO突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及CuO突变体及其可诱导系统。所述CuO突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3,SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示。本发明专利技术通过对CuO P2元件序列进行了随机突变，建立了一个具有大量突变体的突变文库，通过该突变文库进行筛选，获得了多个本底泄露低、诱导表达更强的CuO突变体。这些CuO突变体可应用于CuO

【技术实现步骤摘要】
一种CuO突变体及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种CuO突变体及其应用。

技术介绍

[0002]Cumate可诱导表达系统是来源于恶臭假单胞菌中发现的操纵子系统构建的真核细胞可诱导系统。细菌阻遏蛋白CymR可以特异性的结合到启动子下游的结合序列CuO(Cumate Operator)元件上，从而抑制启动子的转录。而诱导剂4
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异丙基苯甲酸(Cumate)，能够和CymR蛋白结合，并引起CymR蛋白的构象变化，从而使CymR不再与CuO序列结合，从而消除对启动子转录的抑制，如图1所示。
[0003]因为CuO元件可以灵活的放置到CMV，EF1a，CAG和UBC等启动子的下游，从而组成可诱导系统。相对于传统的TetON系统，CuO
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CymR可诱导系统的灵活性更高，并可以搭配多种Pol II型启动子，在生物学基础研究领域具有重要的应用。但是现有CuO
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CymR可诱导系统仍有较强的本底泄露发生，影响了该系统的进一步应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的至少一个目的是专利技术新的本底泄露低，且诱导表达更强的CuO突变体。
[0005]野生型的CuO P2元件长度为28bp，是最常使用的序列之一。本专利技术通过对CuO P2元件序列回文序列两侧以及中间的6个碱基进行了随机突变，建立了一个包含65536种突变体的多样性突变文库，通过该突变文库进行筛选，获得了多个本底泄露低，且诱导表达更强的突变体。
[0006]具体的，本专利技术包括以下技术方案：本专利技术第一个方面公开了多种CuO突变体，所述CuO突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3, SEQ ID NO：4或 SEQ ID NO：6所示。
[0007]应该理解，在保持功能不变的情况下，与上述序列（及本专利技术中的其他序列）具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的序列也在本专利技术的保护范围之内。所述的序列的差异由碱基的取代、缺失或添加所致，本领域技术人员有能力，例如通过非保守碱基的替换，获得功能相似的序列，这样的序列在本专利技术的保护范围之内。
[0008]本专利技术第二个方面公开了一种筛选CuO突变体的方法，包括：S1：mCuOx文库构建；S2：mCuOx文库病毒包装；S3：mCuOx文库筛选；S4：mCuOx文库测序；S5：将突变体CuO与野生型CuO可诱导系统进行比较，得到目的CuO突变体。
[0009]应当理解，本专利技术中在S1之前、S2和S3之间、S3和S4之间、S4和S5之间、S5之后还可以包括其他额外的步骤，且均在本专利技术的保护范围之内。
[0010]优选的，在S1中，将野生型CuO的序列两端和中间6个碱基进行随机突变，得到mCuOx文库。
[0011]优选的，在S2中，将pSLenti
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CMV
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mCuOx
ꢀ‑
EGFP
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3FLAG
‑
PGK
‑ꢀ
puro突变体慢病毒质粒文库，扩增后抽提质粒，采用慢病毒三质粒包装系统，包装慢病毒，获得mCuOx突变体文库慢病毒。
[0012]应当理解，本专利技术中的慢病毒载体并不限于pSLenti
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CMV
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mCuOx
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EGFP
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3FLAG
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PGK
‑ꢀ
puro，本领域技术人员可以根据需要选择任意合适的慢病毒载体来完成本专利技术的技术方案，且均在本专利技术的保护范围之内。
[0013]在本专利技术的一些具体实施例中，mCuOx文库构建：NACAAACAGACNNNNNNGTCTGTTTGTN (SEQ ID NO：11)；构建过程包括：将H13781载体的BsmBI和EcoRI之间的序列:Ggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgactctactagaggatcgctagcgctaccggactcagatctcgagctcaagcttc(SEQ ID NO：12)替换为:GgagacgttgaaNACAAACAGACNNNNNNGTCTGTTTGTNttataagtaaggactagt(SEQ ID NO：13)获得pSLenti
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CMV
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mCuOx
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EGFP
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3FLAG
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PGK
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puro。
[0014]优选的，所述S3包括：S31：将包装好的mCuOx突变体文库慢病毒，使用低MOI(MOI=0.5)感染细胞，接着进行荧光分选检测，分离并富集绿色荧光亮度强（荧光亮度前5%~10%）的细胞；S32：使用CymR过表达病毒感染S31中得到的细胞，接着进行荧光分选检测，分离并富集绿色荧光亮度弱（荧光亮度后5%~10%）的细胞。
[0015]优选的，在S4中，将S3中得到的细胞进行基因组抽提后，PCR扩增mCuOx元件，构建到T载体上进行测序，得到mCuOx突变序列。
[0016]优选的，将突变体CuO与野生型CuO可诱导系统的启动子转录抑制效果进行比较，得到目的CuO突变体。在本专利技术的一些具体实施例中，通过荧光的强弱来判断启动子转录抑制效果。
[0017]本专利技术第二个方面公开了上述的方法得到的CuO突变体。
[0018]在本专利技术的一些具体实施例中，获得mCuO01
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mCuO09等9个非重复的突变序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1
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9所示。本专利技术中，野生型CuO的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
[0019]本专利技术第三个方面公开了一种质粒，其特征在于，所述质粒包括上述的CuO突变体。本专利技术中，术语“质粒”是指是指在细胞的染色体或核区DNA之外，能够自主复制的DNA分子。
[0020]本专利技术第四个方面公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的质粒。
[0021]本专利技术第五个方面公开了一种CuO
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CymR可诱导系统，所述可诱导系统包括上述的CuO突变体。
[0022]本专利技术第六个方面公开了一种CASP8过表达稳定株，其特征在于，所述CASP8过表
达稳定株利用上述的CuO
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CymR可诱导系统制备得到。
[0023]本专利技术第七个方面公开了根据上述的CuO突变体、上述的质粒、上述的试剂盒或上述的CuO
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CymR可诱导系统在基因领域中的应用。
[0024]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本专利技术的构思与保护范围。
[0025]本专利技术相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：本专利技术通过对CuO P2元件序列进行了随机突变，建立了一个具有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CuO元件突变体，其特征在于，所述CuO突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3, SEQ ID NO：4或 SEQ ID NO：6所示。2.一种质粒，其特征在于，所述质粒包括权利要求1所述的CuO突变体。3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的质粒。4.一种CuO
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CymR可诱导系统，其特征在于，所述可诱导系统包括权...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨兴林，杨佳丽，潘讴东，杨蕊菊，高花，
申请(专利权)人：和元生物技术上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：