SVCV的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法和捕获试剂技术

本申请涉及生物捕获技术领域，尤其涉及一种SVCV的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法和捕获试剂。该捕获方法包括如下步骤：将Sulfo

【技术实现步骤摘要】
SVCV的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法和捕获试剂


[0001]本申请属于生物捕获
，尤其涉及一种SVCV的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法和捕获试剂。

技术介绍

[0002]鲤春病毒血症(Spring Viraemia of Carp，SVC)是鲤科鱼类的一种高度传染性的流行病，该病的病原是鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus，SVCV)，我国将其列为一类动物疫病，就其传染性而言，可以称为“水生动物中的禽流感”。SVCV的宿主范围广，能感染鲤科四大家鱼，非鲤科鱼如欧鲶也能被感染，鲤鱼是其中主要的和最易感的宿主(OIE，2009)。SVCV能否感染宿主主要与两个因素有关：1.SVCV与宿主靶器官细胞的识别和侵入；2.宿主对SVCV的免疫。上述差异的原因在动物机体水平层面两种因素都存在，但是在细胞水平层面则与病毒同靶器官细胞表面受体的特异性结合紧密相关。
[0003]细胞受体是能特异性与病毒结合、介导病毒内化并促进病毒侵入的细胞膜组分，它决定着病毒宿主范围和对组织及细胞的亲嗜性。水生动物的传染病水平传播时，媒介是其生活的水源，由于水环境的共用性，同一水源的各种水生动物必然接触传染源，病毒能否感染环境中的水生动物，首先决定于病毒对宿主细胞的亲嗜性。因此，病毒受体的研究是了解疫病传播途径很重要的一个环节，相比陆生动物病毒，对SVCV研究的科学意义尤其突出。目前，国内外没有关于SVCV感染鲤科鱼类所识别的细胞表面受体的文献报道。解析SVCV的细胞受体，能够解答SVCV跨种间感染的差异和细胞对SVCV病毒4种基因型毒株敏感性不同的原因等科学问题，在理论上推动深入研究SVCV感染宿主的机理，在实践中对SVC发病的风险评估及防控研究具有重要的指导意义。
[0004]病毒的细胞受体研究方法主要有：
①
病毒覆盖蛋白结合法(Virus Overlay Protein
‑
binding Assay，VOPBA)；
②
免疫共沉淀法(Coimmunoprecipitation，Co
‑
IP)；
③
GST亲和层析和GST Pull
‑
down方法；
④
表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)；
⑤
酵母双杂交技术；
⑥
噬菌体表面展示技术等方法，研究受体的方法大体上就是研究蛋白质相互作用的方法。各种方法均有优缺点，例如通过VOPBA方法通常只能了解病毒受体的分子量大小，不能提供有关受体蛋白的其他线索，实际上还是不能明确病毒受体到底是什么；免疫共沉淀的优点是可以直接检测细胞提取物，蛋白质接近天然状态和构象，但是不能保证沉淀的蛋白复合物是否为直接相互作用的两种蛋白，并且敏感性较差；表面等离子体共振可以捕获受体分子并测定结合的动力学参数，但是无法鉴别相互作用物质，存在假阳性的情况；酵母双杂交技术和噬菌体表面展示技术的优点是灵敏度高，缺点是基于多肽的相互作用，不能完全代表病毒与蛋白质之间的相互作用，容易出现假阳性和假阴性现象。
[0005]目前，未见SVCV与其宿主相互作用分子基础的研究。

技术实现思路

[0006]本申请的目的在于提供一种SVCV的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法和捕获试剂，
旨在如何捕获SVCV与其宿主细胞相互作用的细胞膜结合蛋白的技术问题。
[0007]为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
[0008]第一方面，本申请提供一种SVCV的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法，包括如下步骤：
[0009]将Sulfo
‑
SBED分子标记在第一鲤春病毒血症病毒上，加入第一宿主细胞进行第一孵育处理，然后进行紫外光交联反应，切割所述Sulfo
‑
SBED分子中的二硫键，利用第一链霉亲和素树脂纯化得到第一捕获蛋白；
[0010]将LC
‑
SPDP分子结合在第二鲤春病毒血症病毒上，然后与化学结构如下所示的SABa分子交联，加入第二宿主细胞进行第二孵育处理，切割二硫键，利用第二链霉亲和素树脂纯化得到第二捕获蛋白；
[0011]将所述第一捕获蛋白和所述第二捕获蛋白通过生物信息学分析，确定捕获到的宿主细胞膜结合蛋白；
[0012][0013]其中，n1为1～8的整数，n2为1～8的整数。
[0014]本申请的捕获方法，通过Sulfo
‑
SBED分子和SABa分子分别标记鲤春病毒血症病毒，然后分别与宿主细胞孵育，再分别采用紫外光激活光交联反应和化学交联形成稳定的共价结合，以捕获SVCV结合蛋白，通过链霉亲和素树脂纯化捕获蛋白后进行生物信息学分析，确定捕获到的宿主细胞膜结合蛋白；该捕获方法可以实现在活细胞上研究SVCV病毒的宿主细胞膜结合蛋白的有效捕获，在SVCV病毒受体研究中具有很好的应用价值。
[0015]第二方面，本申请提供一种SVCV的宿主细胞膜结合蛋白的捕获试剂，所述捕获试剂包括：分别独立包装的Sulfo
‑
SBED分子、SABa分子和LC
‑
SPDP分子；所述Sulfo
‑
SBED分子用于标记鲤春病毒血症病毒，所述SABa分子用于标记鲤春病毒血症病毒，所述SABa分子的化学结构如下所示，所述LC
‑
SPDP在所述SABa分子和鲤春病毒血症病毒之间起连接作用；
[0016][0017]其中，n1为1～8的整数，n2为1～8的整数。
[0018]本申请的捕获试剂包括独立包装的Sulfo
‑
SBED分子、SABa分子和LC
‑
SPDP分子；该捕获试剂可以用于有效捕获SVCV的宿主细胞膜结合蛋白，在SVCV病毒受体研究中具有很好的应用价值。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1是本申请实施例提供的SABa分子标记SVCV的流程示意图；
[0021]图2是本申请实施例提供的捕获蛋白Unigene12835跨膜分析图；
[0022]图3是本申请实施例提供的捕获蛋白Unigene13423跨膜分析图；
[0023]图4是本申请实施例提供的捕获蛋白Unigene19308跨膜分析图；
[0024]图5是本申请实施例提供的捕获蛋白Unigene7122跨膜分析图；
[0025]图6是本申请实施例提供的捕获蛋白CL1989.Contig1跨膜分析图；
[0026]图7是本申请实施例提供的捕获蛋白CL3290.Contig2跨膜分析图；
[0027]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SVCV的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法，其特征在于，包括如下步骤：将Sulfo
‑
SBED分子标记在第一鲤春病毒血症病毒上，加入第一宿主细胞进行第一孵育处理，然后进行紫外光交联反应，切割所述Sulfo
‑
SBED分子中的二硫键，利用第一链霉亲和素树脂纯化得到第一捕获蛋白；将LC
‑
SPDP分子结合在第二鲤春病毒血症病毒上，然后与化学结构如下所示的SABa分子交联，加入第二宿主细胞进行第二孵育处理，切割二硫键，利用第二链霉亲和素树脂纯化得到第二捕获蛋白；将所述第一捕获蛋白和所述第二捕获蛋白通过生物信息学分析，确定捕获到的宿主细胞膜结合蛋白；其中，n1为1～8的整数，n2为1～8的整数。2.如权利要求1所述的捕获方法，其特征在于，所述捕获方法还包括：将所述第一捕获蛋白与Sulfo
‑
SBED分子未标记的第一阴性对照组对比，得到所述第一捕获蛋白中未在第一阴性对照组中出现的蛋白，将所述第二捕获蛋白与LC
‑
SPDP分子未标记的第二阴性对照组比对，得到所述第二捕获蛋白中未在第二阴性对照组中出现的蛋白，然后再进行所述生物信息学分析。3.如权利要求2所述的捕获方法，其特征在于，所述生物信息学分析的步骤包括：采用跨膜区分析工具TMHMM在基于马尔可夫模型预测跨膜螺旋的程序上，对所述第一捕获蛋白中未在第一阴性对照组中出现的蛋白和所述第二捕获蛋白中未在第二阴性对照组中出现的蛋白进行预测。4.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓利，谭景云，香凤，兰文升，
申请(专利权)人：深圳市检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：