本发明专利技术提供一种强致病力大豆胞囊线虫4号生理小种、X12和LY1的简易鉴定方法及应用，利用我国优异抗源兴县灰皮支(编号:ZDD2315)和PI567516C作为鉴别寄主，能有效区分这三个强致病力的大豆胞囊线虫生理小种。该方能通过对具有强致病力的大豆胞囊线虫生理小种的区分，能够有针对性的筛选抗强致病力大豆胞囊线虫的抗源、能够实现开展强致病力的大豆胞囊线虫生理小种在大豆产区的分布和扩散、能够开展大豆胞囊线虫致病基因研究，以及能够针对性的对感染强致病力大豆胞囊线虫的大豆产区采用有力防御措施，具有重要意义。具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种强致病力大豆胞囊线虫4号生理小种、X12和LY1的简易鉴定方法及应用
[0001]本专利技术涉及一种强致病力大豆胞囊线虫4号生理小种、X12和LY1的简易鉴定方法及应用，属于生物
技术介绍
[0002]大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode,SCN)病是一种世界性大豆病害，常年给全球大豆生产造成数十亿美元的经济损失。由于SCN属于土传病害，一旦大豆种植区受到侵染，极难根除。尽管目前国内尚未有官方数据统计每年SCN给中国大豆生产带来的经济损失，但前期对黄淮地区调查研究发现，在中国两大大豆主产区之一的黄淮海大豆产区，约有70％的地区分布有大豆胞囊线虫，在受到SCN严重感染的山西省，部分大豆田出现了“火烧苗”、植株矮化和黄化症状。
[0003]在2012
‑
2015年调查研究中，还发现了具有超强致病力的大豆胞囊线虫新生理小种X12(生理小种，以下简称小种)，目前国内外在用主要抗源对大豆胞囊线虫新小种X12均表现感病或高感。这些抗源包括Riggs鉴别模式中的4个鉴别寄主、HG鉴别模式中的7个鉴别寄主、中国的优异抗源兴县灰皮支(ZDD2315)、PI567516C和美国目前在用的重要抗源PI437654。该小种的出现给大豆生产造成巨大威胁。另外，致病性较强的线虫还有4号生理小种(集中分布在山西省)和LY1线虫(利用2号生理小种和3号生理小种通过杂交人工合成的线虫群体)，目前在美国仅用于SCN相关研究，LY1在自然界中尚未见报道。
[0004]对大豆胞囊线虫生理小种分类国际通用的方法有2种：Riggs和Schmitt于1988年建立的利用4个鉴别寄主(Pickett、Peking、PI88788、PI90763)将大豆胞囊线虫划分为16个小种模式，以及Niblack等在2002年建立的利用7个鉴别寄主(PI548402、PI88788、PI90763、PI437654、PI89772、PI209332、PI548316)将大豆胞囊线虫划分为128个小种的“HG类型”模式，这两种方法均是利用鉴别寄主区分致病力不同的线虫群体。2种划分方法各有其适宜的使用范畴，但在中国，相关研究专家多采用Riggs鉴别模式。随着致病性超强的X12小种出现，Riggs鉴别模式已经不能将4号生理小种、X12和LY1区分开，因为这三个生理小种均能在Riggs鉴别模式中的4个鉴别寄主上成功寄生，也就是说这4个鉴别寄主对这三个生理小种均表现感病；HG type鉴别模式不能将X12和LY1区分开，因为这两个生理小种均能在HG type鉴别模式中的7个鉴别寄主上成功寄生，也就是说这7个鉴别寄主对这两个生理小种均表现感病。
[0005]以上现象表明：已有的2套大豆胞囊线虫生理小种鉴别模式所采用的寄主已不能有效将4号生理小种、X12、和LY1区分，在一定程度上阻碍了SCN相关研究的开展。
技术实现思路
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种强致病力大豆胞囊线虫4号生理小种、X12和LY1的简易鉴定方法及应用，利用我国优异抗源兴县灰皮支(编号:ZDD2315)和
PI567516C作为鉴别寄主，能有效区分这三个强致病力的大豆胞囊线虫生理小种。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]一种强致病力大豆胞囊线虫4号生理小种、X12和LY1的简易鉴定方法，包括以下步骤：
[0009](1)采集受大豆胞囊线虫感染的病土，将病土与无菌细沙以3∶0.5～1.0的体积比均匀混合，制备成试验病土，分装在大豆胞囊线虫抗性鉴定用的实验杯中；
[0010](2)将萌发3～5d、子叶出土期的感病品种Lee植株移栽至装有试验病土的实验杯中，每个实验杯移栽1株，置于温室培养；
[0011](3)培养20～25d后，将Lee植株从试验病土中倒出，采用淘洗
‑
过筛法将从根系中分离的大豆胞囊，搜集至100目筛网上；
[0012](4)用橡皮塞破碎大豆胞囊、释放虫卵，并搜集虫卵至500目筛网上，利用蔗糖梯度离心法对搜集的虫卵进行纯化处理；
[0013](5)在显微镜下对纯化的大豆胞囊线虫虫卵进行计数，制备接种液，用于后续接种；
[0014](6)将萌发3～5d的2个鉴别寄主兴县灰皮支和PI567516C及感病对照Lee植株移栽至无菌土中，每个材料重复4次，3～5d后长出新根时，接种步骤(5)所得的接种液；
[0015](7)接种后的植株在温室培养25天后，将鉴别材料及对照材料植株从试验病土中倒出，计数根系上大豆胞囊数目；
[0016](8)根据鉴别材料平均每株根系上的大豆胞囊数目计算抗感情况，统计标准如下：若鉴别寄主材料根系上的平均胞囊数目≥感病对照Lee植株寄生胞囊量的10％，表现为感病；若鉴别寄主材料根系上的平均胞囊数目<感病对照Lee植株寄生胞囊量的10％，表现为抗病；
[0017](9)如果感病对照Lee植株上的平均胞囊数目大于或等于100，且2个鉴别寄主材料均表现为感病，则为X12生理小种；若兴县灰皮支表现为抗病、PI567516C表现为感病，则为4号生理小种；若PI567516C表现为抗病，则为LY1生理小种。
[0018]所述病土的采集方法为：在大豆生长期，出苗后35～40天，调查田间大豆根系，在受大豆胞囊线虫感染的大豆田块采集土壤表层以下2cm
‑
6cm间的土壤，备用。
[0019]所述温室培养条件为：白天16h与黑夜8h轮替；温度：白天27℃
±
1℃，黑夜24℃
±
1℃；湿度为70％
±
5％。
[0020]所述蔗糖梯度离心法的具体方法为：将虫卵转移至50mL离心管，体积控制在20mL以内，加入20mL质量分数为40％的蔗糖溶液，轻轻颠倒混匀；在2000rpm条件下离心5min。
[0021]所述接种的具体方法为：用直径
×
长为3
×
75mm螺丝刀头，在紧挨着鉴别材料及对照材料的根系旁边扎孔，随后借助1mL移液枪头辅助将步骤(5)所得接种液通过孔洞注入根系附近，接种时分两次进行，每次注入一个孔，一次接种1500个虫卵/株，共接种3000个虫卵/株，两次接种间隔24h。
[0022]所述的鉴定方法在抗强致病力大豆胞囊线虫抗源筛选中的应用。
[0023]所述的鉴定方法在大豆胞囊线虫致病基因研究中的应用。
[0024]所述的鉴定方法在预防大豆产区感染强致病力大豆胞囊线虫中的应用。
[0025]本专利技术有益效果：
[0026]本专利技术鉴别方法利用我国的两个优异抗源作为鉴别寄主：兴县灰皮支和PI567516C，鉴别方法简单易操作，可以将大豆胞囊线虫4号生理小种、X12和LY1三种具有强致病力的大豆胞囊线虫生理小种有效的区分开。克服了现有Riggs鉴别模式和HG type鉴别模式均无法区分大豆胞囊线虫4号本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种强致病力大豆胞囊线虫4号生理小种、X12和LY1的简易鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集受大豆胞囊线虫感染的病土，将病土与无菌细沙以3∶0.5～1.0的体积比均匀混合，制备成试验病土，分装在大豆胞囊线虫抗性鉴定用的实验杯中；(2)将萌发3～5d、子叶出土期的感病品种Lee植株移栽至装有试验病土的实验杯中，每个实验杯移栽1株，置于温室培养；(3)培养20～25d后，将Lee植株从试验病土中倒出，采用淘洗
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过筛法将从根系中分离的大豆胞囊，搜集至100目筛网上；(4)用橡皮塞破碎大豆胞囊、释放虫卵，并搜集虫卵至500目筛网上，利用蔗糖梯度离心法对搜集的虫卵进行纯化处理；(5)在显微镜下对纯化的大豆胞囊线虫虫卵进行计数，制备接种液，用于后续接种；(6)将萌发3～5d的2个鉴别寄主兴县灰皮支和PI567516C及感病对照Lee植株移栽至无菌土中，每个材料重复4次，3～5d后长出新根时，接种步骤(5)所得的接种液；(7)接种后的植株在温室培养25天后，将鉴别材料及对照材料植株从试验病土中倒出，计数根系上大豆胞囊数目；(8)根据鉴别材料平均每株根系上的大豆胞囊数目计算抗感情况，统计标准如下：若鉴别寄主材料根系上的平均胞囊数目≥感病对照Lee植株寄生胞囊量的10％，表现为感病；若鉴别寄主材料根系上的平均胞囊数目<感病对照Lee植株寄生胞囊量的10％，表现为抗病；(9)如果感病对照Lee植株上的平均胞囊数目大于或等于100，且2个鉴别寄主材料均表现为感病，则为X12生理小种；若兴县灰皮支表现为抗病、PI567516C表现为感病，则为4号生理小种；若PI567516...
【专利技术属性】
技术研发人员：练云，魏荷，王金社，张辉，雷晨芳，李金英，刘九洋，周扬，卢为国，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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