一种绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法技术

本发明专利技术公开了一种绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法，其包括以下步骤：制备目的DNA片段和载体片段；将制备的目的DNA片段与载体片段连接，并导入HD5α感受态细胞，扩繁并提取质粒；将提取的质粒用慢病毒质粒包被，进行病毒扩繁、IPEC

【技术实现步骤摘要】
一种绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法


[0001]本专利技术涉及猪IPEC
‑
J2细胞系的构建
，尤其涉及一种绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法。

技术介绍

[0002]胃肠道癌症是世界范围内的常见病，多发病。CDX2是哺乳动物小肠发育的最关键转录因子，主要负责调控肠道细胞的增殖和分化，从而调控人和动物肠道的正常发育。在病理条件下，CDX2作为一种胃癌和大肠癌的标志基因，是治疗相关癌症的重要靶点，由于人类样本涉及伦理道德约束及病人意愿、生活环境等差异，存在背景条件和采样困难等问题。目前研究人员对于CDX2在胃肠道癌症中的作用及发病机制还知之甚少。因此，建立合适的模型对于研究胃肠道癌症的发病进程、治疗及药物筛选至关重要。
[0003]猪被认为是与人类模型最接近的动物模型之一，其消化道结构与人类相似，因此学界常以猪为研究对象，探究人类的发病机理。目前，猪来源的细胞系有IPEC
‑
J2和IPEC
‑
1等，这些细胞系通常不表达或仅表达较少量的 CDX2，且表达量不稳定。因此，需要建立一种正常细胞来源的、稳定表达 CDX2蛋白的细胞系，用以研究CDX2蛋白在肠道癌症中的作用，并为研究靶向药物提供模型。
[0004]但是，现有技术中以IPEC
‑
1细胞系为对象，pcDNA3.1质粒系统为基础，使用脂质体转染试剂(Lipofectamine 2000)构建的IPEC
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1细胞系。IPECr/>‑
1 该系统的不足和缺陷在于：该系统转染效率较低，需要经过长时间G418试剂的筛选(约21天)；理论上导入细胞的质粒大部分并未直接整合进入细胞的基因组，因此在传代5代及更高的细胞代次时，可能出现目的基因表达降低甚至丢失等现象；此外，pcDNA3.1质粒系统不带有荧光蛋白等标记，无法在转染过程中对于转染效率进行直观判断，在获得细胞系后，也无法对目的蛋白表达情况进行简单有效的判断和鉴定。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种绿色荧光蛋白及猪 CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法，以解决现有细胞系转染效率低，传代表达降低甚至丢失的技术问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术的实施例提供了一种绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法，其包括以下步骤：
[0008]制备目的DNA片段和载体片段，所述目的DNA片段包含CDX2蛋白；
[0009]将制备的目的DNA片段与载体片段连接，并导入HD5α感受态细胞，扩繁并提取质粒；
[0010]将提取的质粒用慢病毒质粒包被，进行病毒扩繁。
[0011]其中，所述制备目的DNA片段和载体片段中，采用EcoR I和BamH I 双酶切质粒制
备目的DAN片段和载体片段，其中，所述目的DNA片段包括 pUC57
‑
pig CDX2、EcoR I、BamH I，所述载体片段包括 pLVX
‑
mCMV
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ZsGreen
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PGK
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Puro、EcoR I、BamH I。
[0012]其中，所述目的DNA片段与载体片段连接步骤中还包括：将目的DNA 片段和载体片段回收纯化，连接后的连接产物包括： pLVX
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mCMV
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ZsGreen
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PGK
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Puro、pig CDX2；其中，所述pLVX
‑
mCMV
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ZsGreen
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PGK
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Puro为回收纯化后的载体，所述pig CDX2为回收纯化后的目的DNA片段。
[0013]其中，所述导入HD5α感受态细胞包括以下步骤：
[0014]将连接产物导入HD5α感受态细胞；
[0015]将导入HD5α感受态细胞的连接产物涂布于LB AMP平板；
[0016]将涂布后的LB AMP平板放入37℃温箱培养；
[0017]从HD5α感受态细胞中大规模提取质粒。
[0018]其中，所述将提取的质粒用慢病毒包被，进行病毒扩繁包括以下步骤：
[0019]将从HD5α感受态细胞中提取得到的质粒转染于HEK283细胞；
[0020]间隔12H收集含有病毒的培养液，采用70000g超速离心收集病毒颗粒。
[0021]其中，所述收集病毒颗粒包括以下步骤：
[0022]将细胞从液氮中取出，快速放入37℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液解冻；
[0023]把解冻后的细胞转移到含有培养基的离心管中，离心收集细胞，室温 1200rpm离心3min，弃上清；
[0024]用完全培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37℃5％CO2 饱和湿度条件下培养；
[0025]将病毒上清液与IPEC
‑
J2细胞共同培养。
[0026]其中，所述将提取的质粒用慢病毒质粒包被，进行病毒扩繁步骤还包括细胞传代的步骤，所述细胞传代包括：
[0027]用0.25％胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞；
[0028]用PBS将细胞润洗2次，每次清洗转速为1200rpm，时长为3min；
[0029]加入完全培养基，吹打细胞，制成单细胞悬液，按1:3的比例传代，37℃、5％CO2饱和湿度条件下扩大培养。
[0030]其中，所述细胞传代步骤之后还包括细胞筛选步骤，所述细胞筛选步骤包括：
[0031]病毒感染48h后，更换含20μg/m puromycin的培养基；
[0032]每2
‑
3天更换新鲜含puromycin的培养基，以替换含大量死细胞的培养基，直到抗性群落能被识别出；
[0033]待抗性细胞长满以后，传代、扩大培养、鉴定及冻存。
[0034]其中，所述待抗性细胞长满以后，传代、扩大培养、鉴定及冻存步骤后还包括：待细胞稳转后，继续加入puromycin培养基进行维持的步骤。
[0035]其中，所述制备目的DNA片段和载体片段和将制备的目的DNA片段与载体片段连接，并导入HD5α感受态细胞，扩繁并提取质粒的步骤中均包括进行电泳验证的步骤。
[0036]与现有技术相比，目前尚无CDX2和GFP同时高效、稳定表达的正常肠上皮细胞系，阻碍了CDX2在肠道发育和胃肠道疾病中的作用机制研究，本专利技术的提出，填补了相应的空白，构建了性质和活力更好的IPEC
‑
J2为模型构建细胞系，提高了转染效率，表达绿色荧光
蛋白GFP，可以在转染过程中对转染效率进行评估，提高了试验效率。
[0037]上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术技术手段，可依照说明书的内容予以实施，并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法，其特征在于，包括以下步骤：制备目的DNA片段和载体片段，所述目的DNA片段包含CDX2蛋白；将制备的目的DNA片段与载体片段连接，并导入HD5α感受态细胞，扩繁并提取质粒；将提取的质粒用慢病毒质粒包被，进行病毒扩繁。2.根据权利要求1所述的绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法，其特征在于，所述制备目的DNA片段和载体片段中，采用EcoR I和BamHI双酶切质粒制备目的DAN片段和载体片段，其中，所述目的DNA片段包括pUC57
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pigCDX2、EcoRI、BamHI，所述载体片段包括pLVX
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mCMV
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ZsGreen
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PGK
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Puro、EcoRI、BamHI。3.根据权利要求2所述的绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法，其特征在于，所述目的DNA片段与载体片段连接步骤中还包括：将目的DNA片段和载体片段回收纯化，连接后的连接产物包括：pLVX
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mCMV
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ZsGreen
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PGK
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Puro、pigCDX2；其中，所述pLVX
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mCMV
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ZsGreen
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PGK
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Puro为回收纯化后的载体片段，所述pigCDX2为回收纯化后的目的DNA片段。4.根据权利要求3所述的绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法，其特征在于，所述导入HD5α感受态细胞包括以下步骤：将连接产物导入HD5α感受态细胞；将导入HD5α感受态细胞的连接产物涂布于LBAMP平板；将涂布后的LBAMP平板放入37℃温箱培养；从HD5α感受态细胞中大规模提取质粒。5.根据权利要求1所述的绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法，其特征在于，所述将提取的质粒用慢病毒包被，进行病毒扩繁包括以下步...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟振亚，牛凯敏，吴信，刘建平，蔡力创，涂越，王汝霞，蒋泽根，欧阳克氙，刘会平，郭雄昌，叶长明，
申请(专利权)人：时代生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：