一种树鼩永生化皮肤成纤维细胞的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种树鼩永生化皮肤成纤维细胞的建立方法，该方法是采用酶消化法从树鼩皮肤组织中分离纯化获得原代树鼩皮肤成纤维细胞，然后利用携带SV40T的慢病毒转染原代细胞，经过50代以上的传代，获得永生化树鼩皮肤成纤维细胞，方法实施过程中细胞培养使用的完全培养基为含有体积百分比10%胎牛血清、1%青

【技术实现步骤摘要】
一种树鼩永生化皮肤成纤维细胞的建立方法


[0001]本专利技术涉及一种树鼩永生化皮肤成纤维细胞的建立方法，属于细胞永生化构建


技术介绍

[0002]皮肤成纤维细胞是网状真皮层中一类较为常见的细胞，能够在结蹄组织中分泌和沉积大量整合素和细胞外基质（extracellular matrix，ECM），包括胶原蛋白、弹性纤维、结合蛋白等。由于能够分泌一系列的ECM，皮肤成纤维细胞在皮肤的衰老、光老化、炎症、皮肤烧伤或机械损伤修复、皮肤瘢痕形成、肿瘤及其他皮肤相关疾病等多种皮肤修复过程中起到至关重要的作用。
[0003]目前已有小鼠皮肤成纤维细胞、大鼠皮肤成纤维细胞、人皮肤成纤维细胞、裸鼹鼠皮肤成纤维细胞以及驴皮成纤维细胞被分离出，并且基于不同物种的皮肤成纤维细胞开展了各个方向的皮肤疾病相关研究。树鼩作为一种小型的攀鼩目动物，具有体型小、繁殖快的特点，进化上比啮齿类更接近非人灵长类，在神经系统、视觉系统和免疫系统上与人相似，已被用于眼部、视神经以及脑部神经发育相关疾病的研究，以及多种肝炎病毒、寨卡病毒、单纯疱疹病毒及流感病毒等病毒性疾病模型中。树鼩皮肤结构解析，发现其与恒河猴及人的皮肤结构极为相似，有丰富的汗腺和皮脂腺，且汗腺分布在毛球顶部周围，与毛囊皮脂腺等一起组成与人相似的附属皮肤单位，表明树鼩在皮肤相关疾病的研究中是一个潜在有可能替代非人灵长类的实验动物。
[0004]团队之前分离出了原代树鼩皮肤成纤维细胞，然而原代细胞往往只有特定的几个代次能够稳定增长，传代次数过多后，细胞便会出现各种问题，细胞形态发生改变，细胞增殖变缓，实验过程中很容易错过细胞的最佳生长时期，这对于构建皮肤疾病相关细胞模型以及相关机制研究有较大阻碍。同时，每一批次分离出的原代细胞难免会有差异，几乎无法重复试验，并且耗时长，实验效率会大大受到影响，而永生化细胞恰恰能够有效弥补原代细胞的上述不足。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种树鼩永生化皮肤成纤维细胞的建立方法，利用本方法可以将树鼩原代皮肤成纤维细胞构建成为能够多次稳定传代的永生化细胞；该方法是采用酶消化法分离得到树鼩原代皮肤成纤维细胞后，采用添加非必需氨基酸和NaHCO3的MEM培养基，利用携带SV40T的慢病毒转染原代细胞，经过50代以上的传代，细胞仍能保持较强的活性和增殖能力，获得永生化树鼩皮肤成纤维细胞；该方法可以有效的诱导树鼩皮肤原代细胞向永生化细胞转化。
[0006]本专利技术树鼩永生化皮肤成纤维细胞的建立方法具体如下：（1）采用酶消化法从树鼩皮肤组织中分离纯化获得原代树鼩皮肤成纤维细胞，分离纯化过程中使用的完全培养基为含有体积百分比10%胎牛血清、1%青
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链霉素、1
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3%
NaHCO3、1
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3%非必需氨基酸的MEM培养基；1%青
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链霉素、非必需氨基酸为常规市售产品，购自Gibco。
[0007]（2）将纯化后的原代皮肤成纤维细胞接种于6孔板， 在37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞汇合度达到80%以上时，用PBS缓冲液清洗2
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3次后，加入含助转剂的完全培养基，并接种HBLV
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SV40T
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3xflag
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PURO慢病毒，同时以未接种慢病毒的细胞作为对照，在37℃、5%CO2培养箱中培养4h后补加含助转剂的完全培养基，培养24h后更换不含助转剂的完全培养基继续培养24h，最后用含4μg/mL嘌呤霉素的完全培养基进行嘌呤霉素药物筛选，2天更换一次培养液，直至对照细胞完全死亡；所述助转剂为聚凝胺，添加量为4μg/mL；慢病毒按MOI=30接种。
[0008]（3）筛选获得的细胞用质量浓度0.25% trypsin
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EDTA胰蛋白酶消化并计数，按10倍稀释法将细胞稀释至10cells/mL的浓度，然后接种于96孔板上，100μL/孔，每隔一天观察一次，选取并标记由单个细胞增殖形成的单个细胞群，单克隆细胞长至汇合率达80%以上时，弃去培养液，PBS清洗，用质量浓度0.25% trypsin
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EDTA胰蛋白酶消化，倒置显微镜下观察细胞，待大部分细胞变圆或肉眼培养瓶底部变成毛玻璃状时，弃胰酶后加入完全培养液终止消化并悬浮细胞进行后续逐步扩大培养，每消化一次记为一代，稳定传代50代以上具有较好的生长状态和较强的增殖能力的细胞，即为树鼩永生化皮肤成纤维细胞；观察细胞时需对单个贴壁细胞进行标记，之后选取由单个细胞长成的细胞群。
[0009]（4）对上述细胞进行特异性蛋白免疫荧光鉴定，所用抗体为1:500稀释的鼠抗波形蛋白单克隆抗体（abcam）和1:50的兔抗SV40T单克隆抗体（abcam），镜下可见明显Vimentin和SV40T荧光；本专利技术中慢病毒为携带SV40T基因的慢病毒载体。
[0010]采用此建立树鼩永生化皮肤成纤维细胞的方法，可以有效的建成树鼩永生化的皮肤成纤维细胞，所得到的细胞能够稳定传代至50代以上，有效维持了树鼩皮肤成纤维细胞稳定的生长状态和增殖能力，实现细胞的即用即取，省去了每次实验需要重新分离纯化细胞的步骤，为皮肤相关疾病发病机制研究提供了新材料。
[0011]本专利技术培养基除基础培养基MEM+1%青
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链霉素+10%FBS外，未添加人皮肤成纤维细胞所需的低血清生长添加物（LSGS，成分包括胎牛血清和FGF、EGF等细胞因子），而只添加了1
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3%的非必需氨基酸和1
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3%的NaHCO3，使用该培养基，能够使细胞维持较好的状态，即使多次传代后细胞的生长状态也未出现较大差异，细胞增殖能力仍然较强，避免细胞需要依靠生长因子来维持增殖的情况，一方面节省了细胞培养成本，另一方面也减少了人为添加生长因子对于细胞生长微环境的改变和影响。
[0012]与现有细胞相比，本专利技术首次提供了树鼩皮肤成纤维细胞的建立方法，可以得到有明显标志性蛋白Vimentin和永生化基因SV40T的树鼩永生化皮肤成纤维细胞，增加了细胞的特异性，实现了不同代次间细胞生长状态和增殖能力的稳定性；填补了目前没有针对树鼩这一物种的永生化皮肤成纤维细胞这一空缺，利用树鼩与人亲缘关系近且皮肤结构与人相似的特点，为人类皮肤相关疾病的研究提供了能够稳定传代的皮肤成纤维细胞；实现了相关研究中作为实验材料能够即用即取，省去了每次需要时都要从组织中分离培养的繁琐，稳定的细胞状态能够保证实验的可重复性。
附图说明
[0013]图 1为不同培养代次的树鼩皮肤成纤维细胞的显微镜图（200
×
）；其中A图为第20代，B图为第30代，C图为第38代，D图为第52代；图 2为第52代树鼩皮肤成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定结果示意图（200
×
），图A是树鼩皮肤成纤维细胞波形蛋白（绿色）；图B是树鼩皮肤成纤维细胞核DAPI（蓝色）；图C是树鼩皮肤成纤维细胞波本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种树鼩永生化皮肤成纤维细胞的建立方法，其特征在于：采用酶消化法从树鼩皮肤组织中分离纯化获得原代树鼩皮肤成纤维细胞，然后利用携带SV40T的慢病毒转染原代细胞，经过50代以上的传代，获得永生化树鼩皮肤成纤维细胞，方法实施过程中细胞培养使用的完全培养基为含有体积百分比10%胎牛血清、1%青
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链霉素、1
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3%NaHCO3、1
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3%非必需氨基酸的MEM培养基。2.根据权利要求1所述的树鼩永生化皮肤成纤维细胞的建立方法，其特征在于，具体操作如下：（1）采用酶消化法从树鼩皮肤组织中分离纯化获得原代树鼩皮肤成纤维细胞，分离纯化过程中使用的完全培养基为含有体积百分比10%胎牛血清、1%青
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链霉素、1
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3%NaHCO3、1
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3%非必需氨基酸的MEM培养基；（2）将纯化后的原代皮肤成纤维细胞接种于6孔板， 在37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞汇合度达到80%以上时，用PBS缓冲液清洗2
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3次后，加入含助转剂的完全培养基，并接种HBLV
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SV40T
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3xflag
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【专利技术属性】
技术研发人员：陆彩霞，奎秀莹，代解杰，罕园园，王文广，李娜，仝品芬，孙晓梅，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：