一种用于多基因转化的慢病毒载体表达系统技术方案

本发明专利技术提供一种利用分裂单一筛选标记实现对多基因转化的慢病毒载体表达系统，包括慢病毒载体表达系统、其构建方法以及在多基因转化中的应用。利用本发明专利技术的慢病毒载体表达系统，可以用单一筛选标记实现多个目的基因的转化，可以在多种细胞中提高表达系统的包装率和提高目的基因的表达率。提高目的基因的表达率。提高目的基因的表达率。

【技术实现步骤摘要】
一种用于多基因转化的慢病毒载体表达系统


[0001]本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种利用分裂单一筛选标记实现对多基因转化的慢病毒载体表达系统，包括慢病毒载体表达系统、其构建方法以及在多基因转化中的应用。

技术介绍

[0002]慢病毒载体(Lentiviral vector)是在HIV
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1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体介导的基因表达持续且稳定，原因是插入基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒有广泛的宿主，可感染分裂和不分裂的细胞，几乎可以感染所有类型的细胞，特别适合质粒载体转染效率低的细胞。
[0003]目前常用的慢病毒表达载体多是采用双启动子的表达元件串联的，同时具有抗生素抗性基因和荧光蛋白双重筛选基因，用于选择目的基因型的工程细胞，但是选择有限。只有几种有限数量的具有良好特征的抗生素耐药基因可用于真核细胞，同样也只有几种限数量的荧光蛋白的光谱可通过常用设备明确区分。如果研究人员要将多个基因转入一个细胞，他们经常会遇到没有足够的可选择标记的问题。另一方面，同时使用多种抗生素进行选择，对细胞往往是严酷的。
[0004]2006年，山中伸弥的团队专利技术了一种由OCT4，SOX2，KLF4和c
‑
Myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞。这一突破性的专利技术突破了在医学上使用人胚胎干细胞的伦理限制，大大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。但是这四个基因同时在一个慢病毒载体表达时，慢病毒的包装效率与这四个基因的表达都比较低，如何将这些具有广泛应用前景的目的基因进行有效包装，提高基因的表达率是我们亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，让多个基因在一种筛选条件下被选择，本专利技术提供一种慢病毒载体表达系统、其构建方法与应用，具体的：本专利技术第一方面，提供一种慢病毒载体表达系统，所述慢病毒载体表达系统包括两个载体，其中第一个慢病毒载体包括N
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Screening Marker
‑
TS1片段，所述N
‑
Screening Marker
‑
TS1片段包括编码筛选标记蛋白的N端氨基酸的标记基因5
’
端核苷酸序列（N
‑
Screening Marker）和剪切接头1（TS1），第二个慢病毒载体包括TS2
‑
C
‑
Screening Marker片段，所述TS2
‑
C
‑
Screening Marker片段包括剪切接头2（TS2）和编码筛选标记蛋白的C端氨基酸的标记基因3
’
端核苷酸序列（C
‑
Screening Marker），所述两个慢病毒载体中的筛选标记蛋白相同，所述筛选标记蛋白的N端氨基酸和C端氨基酸连接后具有筛选标记功能。
[0006]优选的，所述标记基因包括选择基因和报告基因，优选的，所述选择基因包括抗生素抗性基因，更优选的，所述抗生素抗性基因包括但不仅限于新霉素磷酸转移酶基因
（npt），卡那霉素抗性基因（nptII），嘌呤霉素抗性基因（Puro），四环素抗性基因，青霉素抗性基因，链霉素抗性基因等等；所述报告基因包括氯霉素乙酰转移酶 （CAT），β
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半乳糖苷酶基因（LacZ），二氢叶酸还原酶基因，人生长激素（hGH），分泌型碱性磷酸酶（SEAP），荧光素酶（Luciferase），荧光蛋白等。
[0007]本专利技术的一个具体实施方式中，上述慢病毒载体系统中，基于病毒RNA的剪接顺式元件，将筛选标记分成N端和C端两部分，只有当两个慢病毒载体导入同一个细胞，并且转录出相应的筛选标记的N端和C端RNA时，在剪接顺式元件TS1，TS2作用下，会形成一个完整的筛选标记RNA，进一步表达筛选标记蛋白。
[0008]在一个具体的实施方案中，本专利技术提供一种慢病毒表达系统，所述包括慢病毒表达系统两个慢病毒载体，其中第一个慢病毒载体包括pLent
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EF1a
‑
MCS
‑
CMV
‑
N
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Screening Marker
‑
TS1的核苷酸序列，优选的，所述第一个慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]第二个慢病毒表达载体包括pLent
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EF1a
‑
MCS
‑
CMV
‑
TS2
‑
C
‑
Screening Marker的核苷酸序列，优选的，所述第二个慢病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]进一步优选的，其中，Kozak序列的核苷酸序列信息为GCCACC；所述筛选标记基因为嘌呤霉素抗性基因（Puro），编码N
‑ꢀ
Puro 的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；Tans Splicing 1（TS1）序列如SEQ ID NO.4所示；Tans Splicing 2(TS2)序列如SEQ ID NO.5所示；编码C
‑ꢀ
Puro的DNA序列如SEQ ID NO.6所示。优选的，所述第一个慢病毒载体和第二个慢病毒载体还包括多个目的基因。更优选的，所述多个包括至少两个，例如2个，3个，4个，5个，6个或更多。
[0011]更优选的，所述目的基因包括OCT4，SOX2，KLF4，c
‑
Myc，NANOG和LIN28。
[0012]优选的，所述目的基因分别插入到第一个慢病毒载体和第二个慢病毒载体中。
[0013]更优选的，所述第一个慢病毒载体pLent
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EF1a
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Oct4
‑
P2A
‑
Sox2
‑
CMV
‑
N
‑
Puro
‑
TS1，所述第二个慢病毒载体包括pLent
‑
EF1a
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Klf4
‑
P2A
‑
Myc
‑
CMV
‑
TS2
‑
C
‑
Puro。
[0014]进一步优选的，Oct4
‑
P2A
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Sox2核苷酸序列如SEQ ID：NO.7所示，Klf4
‑
P2A
‑
Myc核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0015]本专利技术第二方面，提供一种上述慢病毒载体表达系统的构建方法，其中所述构建方法包括：1）通过PCR技术获得N
‑
Scr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种慢病毒载体表达系统，其特征在于，所述慢病毒载体表达系统包括两个慢病毒载体，其中第一个慢病毒载体包括N
‑
Screening Marker
‑
TS1片段，所述N
‑
Screening Marker
‑
TS1片段包括编码筛选标记蛋白的N端氨基酸的标记基因5
’
端核苷酸序列（N
‑
Screening Marker）和剪切接头1（TS1），第二个慢病毒载体包括TS2
‑
C
‑
Screening Marker片段，所述TS2
‑
C
‑
Screening Marker片段包括剪切接头2（TS2）和编码筛选标记蛋白的C端氨基酸的标记基因3
’
端核苷酸序列（C
‑
Screening Marker），所述两个慢病毒载体中的筛选标记蛋白相同，所述筛选标记蛋白的N端氨基酸和C端氨基酸连接后具有筛选标记功能。2.如权利要求1所述的慢病毒载体表达系统，其特征在于，所述标记基因包括选择基因和报告基因。3.如权利要求1所述的慢病毒载体表达系统，其特征在于，所述第一个慢病毒载体和第二个慢病毒载体还包括多个目的基因。4.如权利要求3所述的慢病毒载体表达系统，其特征在于，所述目的基因包括OCT4 ，SOX2 ，KLF4和/或c
‑
Myc。5.如权利要求1
‑
4任一所述的慢病毒载体表达系统，其特征在于，所述第一个慢病毒载体包括pLent
‑
EF1a
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MC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈英，郭学双，蒋桂梅，李欣，吴向萍，赵政，
申请(专利权)人：山东维真生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：