一种人多能干细胞制备靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞的方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种人多能干细胞制备靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞的方法与应用。具体地公开了制备CD19

【技术实现步骤摘要】
cell，ESC)和人诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSC)的体外扩增能力(Themeli M,Kloss CC,Ciriello G,Fedorov VD,Perna F,Gonen M,Sadelain M.Generation of tumor
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targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy.Nat Biotechnol.2013；31(10):928
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33.doi:10.1038/nbt.2678.；Knorr DA,Ni Z,Hermanson D,Hexum MK,Bendzick L,Cooper LJ,Lee DA,Kaufman DS.Clinical
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scale derivation of natural killer cells from human pluripotent stem cells for cancer therapy.Stem Cells Transl Med.2013；2(4):274
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283.doi:10.5966/sctm.2012
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0084.)。PSC能在体外以未分化状态无限增殖，结合体外细胞分化技术，理论上PSC可以作为患者NK细胞治疗的无限干细胞来源库，这从根本上解决了细胞来源的问题。但目前已报道的人多能干细胞向NK细胞分化过程，存在过程复杂、周期长、饲养层细胞依赖、培养基成分不明确、纯度和活力低等问题，并且残留的未分化细胞容易造成患癌风险。因此，优化NK细胞的分化方法，提高所获得NK细胞的纯度，去除未分化细胞的影响，提高NK细胞的增殖能力和杀伤能力，从而保障NK细胞治疗临床应用的安全性和有效性，仍是一个亟需探索和研究的方向，研发新的具有强大抗肿瘤作用的效应细胞对肿瘤的免疫细胞治疗具有重要的理论意义和应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是如何制备一种更安全、高效的用于肿瘤免疫细胞治疗靶向CD19的嵌合抗原受体和/或表达所述嵌合抗原受体的CD19
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CAR
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NK细胞。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了制备表达CAR的重组NK细胞(名称为CD19
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CAR
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NK细胞)的方法，所述方法包括如下步骤：使表达CD19
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CAR基因的重组多能干细胞分化为自然杀伤细胞，所述自然杀伤细胞即为表达CAR的重组NK细胞；所述CD19
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CAR是包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的蛋白质；所述胞外结构域包括抗CD19的scFv(CD19 scFv)，所述胞内结构域包括2B4(CD244)的胞内区和DAP10的胞内区。
[0007]所述重组多能干细胞可为人重组多能干细胞。所述胞内结构域中，2B4的胞内区和DAP10的胞内区构成共刺激域。
[0008]所述CD19
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CAR为抗CD19的嵌合抗原受体；所述CD19
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CAR基因为抗CD19的嵌合抗原受体基因；所述CD19
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CAR
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NK细胞为表达CD19
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CAR基因的重组NK细胞。
[0009]本专利技术所述CD19
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CAR在本文和附图中也称NK
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19CAR或19CAR。
[0010]上述方法中，所述CD19
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CAR为下述任一种蛋白质：
[0011]P1、所述跨膜结构域为2B4的跨膜区；
[0012]P2、所述CD19
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CAR的胞内结构域还包括CD3ζ，和/或所述CD19
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CAR还包括CD8铰链区，和/或所述CD19
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CAR还包括信号肽；
[0013]P3、所述跨膜结构域为2B4的跨膜区，和所述CD19
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CAR的胞内结构域还包括CD3ζ，和所述CD19
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CAR还包括CD8铰链区，和所述CD19
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CAR还包括信号肽；
[0014]P4、所述跨膜结构域为2B4的跨膜区，和所述CD19
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CAR的胞内结构域还包括CD3ζ，和所述CD19
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CAR还包括CD8铰链区。
[0015]上述方法中，所述2B4的胞内区是如下任一种蛋白质：
[0016]C1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第333
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446位的蛋白质；
[0017]C2)将SEQ ID No.2的第333
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446位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
[0018]C3)在C1)或C2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
[0019]所述DAP10的胞内区是如下任一种蛋白质：
[0020]D1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第447
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470位的蛋白质；
[0021]D2)将SEQ ID No.2的第447
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470位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
[0022]D3)在D1)或D2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
[0023]所述2B4的跨膜区是如下任一种蛋白质：
[0024]E1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第309
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332位的蛋白质；
[0025]E2)将SEQ ID No.2的第309
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332位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
[0026]E3)在E1)或E2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
[0027]所述CD3ζ是如下任一种蛋白质：
[0028]F1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第471
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582位的蛋白质；
[0029]F2)将SEQ ID No.2的第471
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582位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有信号转导功能的蛋白质；
[0030]F3)在F1)或F2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备表达CAR的重组NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：使表达CD19
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CAR基因的重组多能干细胞分化为自然杀伤细胞，所述自然杀伤细胞即为表达CAR的重组NK细胞；所述CD19
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CAR是包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的蛋白质；所述胞外结构域包括抗CD19的scFv，所述胞内结构域包括2B4的胞内区和DAP10的胞内区。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CD19
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CAR为下述任一种蛋白质：P1、所述跨膜结构域为2B4的跨膜区；P2、所述CD19
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CAR的胞内结构域还包括CD3ζ，和/或所述CD19
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CAR还包括CD8铰链区，和/或所述CD19
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CAR还包括信号肽；P3、所述跨膜结构域为2B4的跨膜区，和所述CD19
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CAR的胞内结构域还包括CD3ζ，和所述CD19
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CAR还包括CD8铰链区，和所述CD19
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CAR还包括信号肽；P4、所述跨膜结构域为2B4的跨膜区，和所述CD19
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CAR的胞内结构域还包括CD3ζ，和所述CD19
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CAR还包括CD8铰链区。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述2B4的胞内区是如下任一种蛋白质：C1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第333
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446位的蛋白质；C2)将SEQ ID No.2的第333
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446位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；C3)在C1)或C2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；所述DAP10的胞内区是如下任一种蛋白质：D1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第447
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470位的蛋白质；D2)将SEQ ID No.2的第447
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470位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；D3)在D1)或D2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；所述2B4的跨膜区是如下任一种蛋白质：E1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第309
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332位的蛋白质；E2)将SEQ ID No.2的第309
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332位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；E3)在E1)或E2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；所述CD3ζ是如下任一种蛋白质：F1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第471
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582位的蛋白质；F2)将SEQ ID No.2的第471
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582位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有信号转导功能的蛋白质；F3)在F1)或F2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有信号转导功能的融合蛋白质；所述CD8铰链区是如下任一种蛋白质：G1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第264
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308位的蛋白质；G2)将SEQ ID No.2的第264
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308位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与G1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
G3)在G1)或G2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；所述抗CD19的scFv是如下任一种蛋白质：H1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第22
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263位的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李扬，周士新，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：