DAPK可变剪切转录本在间充质干细胞成骨向分化中的应用制造技术

本发明专利技术属于再生医学技术领域，具体涉及DAPK可变剪切转录本在间充质干细胞成骨向分化中的应用，本发明专利技术经研究发现了两个与调控成骨向分化密切相关的基因，即DAPK可变剪切转录本DAPK

【技术实现步骤摘要】
沉默DAPK
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X1、DAPK
‑
X2则可促进成骨分化，一方面为DAPK在抑制间充质干细胞成骨向 分化过程中提供了应用依据，为有针对性的运用小分子化合物抑制靶蛋白活性，在克服异位 成骨的治疗方面提供了全新的理论和实验依据；另一方面也为DAPK在以间充质干细胞为基 础的骨组织工程技术的临床转化应用方面提供了新的思路。
[0012]本专利技术提供了一种促进间充质干细胞成骨向分化的方法，即通过敲减DAPK
‑
X1和/或 DAPK
‑
X2来促进间充质干细胞成骨向分化。该方法可以应用于骨组织再生的治疗方面。
[0013]优选地，上述的一种促进间充质干细胞成骨向分化的方法，具体为通过siRNA沉默间充 质干细胞中的DAPK
‑
X1和/或DAPK
‑
X2的方式来促进间充质干细胞成骨向分化。
[0014]进一步地，所述siRNA为DAPK si2，所述DAPK si2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0015]本专利技术提供了一种抑制间充质干细胞成骨向分化的方法，即通过过表达DAPK
‑
X1和/或 DAPK
‑
X2来抑制间充质干细胞成骨向分化。该方法可以应用于克服异位成骨的问题。
[0016]优选地，上述的一种抑制间充质干细胞成骨向分化的方法，具体为通过向间充质干细胞 转染过表达DAPK
‑
X1质粒和/或过表达DAPK
‑
X2质粒的方式来抑制间充质干细胞成骨向分 化。
[0017]本专利技术提供了一种间充质干细胞成骨向分化增强剂，该增强剂包括DAPK si2，所述DAPKsi2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0018]本专利技术提供了一种间充质干细胞成骨向分化抑制剂，该抑制剂包括过表达DAPK
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X1质 粒和/或过表达DAPK
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X2质粒。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0020]本专利技术经研究发现了两个与调控成骨向分化密切相关的基因，即DAPK可变剪切转录本 DAPK
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X1和DAPK
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X2。并且发现，DAPK
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X1和/或DAPK
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X2的过表达能够抑制间充质干细 胞成骨向分化，沉默，DAPK
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X1和/或DAPK
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X2则可促进间充质干细胞成骨向分化，从而揭 示了DAPK
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X1、DAPK
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X2对间充质干细胞成骨向分化的调控作用，说明DAPK
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X1、DAPK
‑
X2 可以用于抑制或促进间充质干细胞成骨向分化，从而克服异位成骨或诱导骨组织再生；一方 面为研发小分子化学工具调控干细胞成骨定向分化提供了全新的作用靶点，另一方面为以干 细胞为基础的骨组织工程技术的临床转化应用奠定了坚实的基础。
附图说明
[0021]图1为5
’
和3
’
RACE的PCR产物的电泳图；
[0022]图2为DAPK、DAPK
‑
X1和DAPK
‑
X2核苷酸长度示意图；
[0023]图3为人骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中DAPK
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X1、DAPK
‑
X2的表达量变化图；
[0024]图4为过表达DAPK
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X1、DAPK
‑
X2分子对人骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响图 (PRK5为空载体，是阴性对照)；
[0025]图5为敲减DAPK
‑
X1、DAPK
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X2基因对人骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响图。
具体实施方式
[0026]下面对本专利技术的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的 说明用于帮助理解本专利技术，但并不构成对本专利技术的限定。此外，下面所描述的本发
明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0027]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
[0028]实施例中涉及的中英文缩写如下：
[0029]ALPalkalinephosphatase，碱性磷酸酶；
[0030]BCABicinchoninincacid，二辛可宁酸；
[0031]DAPKDeath
‑
associatedProteinKinase，死亡相关蛋白激酶；
[0032]DEPCDiethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯；
[0033]GAPDHGlyceraldehyde
‑3‑
phosphatedehydrogenase，甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶；
[0034]BMP2BoneMorphogeneticProtein2，骨形态发生蛋白2；
[0035]OCNosteocalcin，骨钙素；
[0036]qRT
‑
PCRQuantitativereversetranscriptionPCR，逆转录定量聚合酶链式反应；
[0037]RUNX2runt
‑
relatedtranscriptionfactor2Runt，相关转录因子2；
[0038]CPCCetylpyridinechloridemonohydrate，氯化十六烷基吡啶一水。
[0039]实施例1DAPK可变剪切转录本DAPK
‑
X1、DAPK
‑
X2的鉴定和测序
[0040]1、细胞培养
[0041]人骨髓间充质干细胞来源于健康志愿者，已获得中山大学附属第八医院伦理委员会的审核批准。所用增殖培养基为低糖DMEM(购自Gibco)添加10％胎牛血清(购自四季青公司)。将培养至P3代的MSC(培养方法见发表文献：PengW,LiY,HuangL.EffectsandsafetyofallogenicmesenchymalstemcellintravenousinfusioninactiveankylosingspondylitispatientswhofailedNSAIDs:a20
‑
weekclinicaltrial.[J].CellTransplantation,2014,23(10):1293
‑
303.)接种于培养皿中，利用增殖培养基在37℃、5％CO2下进行培养，每3天半量换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长至80％汇合状态时，使用0.25％胰蛋白酶消化传代，传代后的P3
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.DAPK可变剪切转录本在制备调控间充质干细胞成骨向分化产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DAPK可变剪切转录本包括DAPK
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X1和/或DAPK
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X2，所述DAPK
‑
X1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DAPK
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X2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为人骨髓来源的间充质干细胞。4.一种促进间充质干细胞成骨向分化的方法，其特征在于，通过敲减DAPK
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X1和/或DAPK
‑
X2来促进间充质干细胞成骨向分化。5.根据权利要求4所述的一种促进间充质干细胞成骨向分化的方法，其特征在于，通过siRNA沉默间充质干细胞中的DAPK
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X1和/或DAPK
‑
X2的方式来促进间充质干细胞成骨向分化...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈慧勇，吴燕峰，旺姗，王子明，曾琛莹，陈锋磊，
申请(专利权)人：中山大学附属第八医院深圳福田，
类型：发明
国别省市：