引入靶特异性外源基因的方法技术

本公开提供了可用于通过TI(靶向整合)转化动物细胞的热点。在CHO细胞基因组中LOC103164262附近发现了本公开的热点。或者，本公开涉及已将外源DNA引入到所述热点中的转化细胞，以及通过培养细胞产生由所述DNA编码的多肽的方法。的多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】引入靶特异性外源基因的方法


[0001]本公开涉及以靶特异性方式将外源DNA引入动物细胞基因组的方法、通过使用这些方法获得的转化细胞、以及生产由外源DNA编码的多肽的方法。

技术介绍

[0002]通过基因重组技术在培养细胞中表达诸如细胞因子或抗体的多肽并大量生产该多肽的方法是众所周知的。此类多肽生产技术通常包括将编码目标多肽的多核苷酸以可表达形式引入细胞以产生转化细胞和从其培养物中回收积累的目标多肽的步骤。广泛用作待转化细胞的是微生物、昆虫、植物或动物的细胞。其中，动物细胞被广泛用作获得动物源多肽的合适的宿主细胞。通过在动物细胞中表达多肽，预期多肽的诸如糖基化和折叠的翻译后修饰将以更接近生物体中产生多肽的环境的方式发生。
[0003]当在动物细胞中表达外源DNA时，通常用包含编码目标多肽的多核苷酸的表达载体转化动物细胞。然而，与引入基因组时不同，作为表达载体引入细胞的外源DNA通常不会复制，也不会通过细胞分裂遗传，因此难以稳定地保留其性状。因此，尽管用表达载体的转化对于在实验环境中用于瞬时表达是有用的，但它在工业生产中的应用留下了问题。
[0004]通过将外源DNA引入动物细胞的基因组，可以稳定地保留源自表达载体的性状。这是因为引入基因组的多核苷酸极有可能通过细胞分裂进行复制并稳定保留。基于这一想法，以动物细胞为平台，以工业规模稳定生产多种生物物质成为可能。
[0005]但是，很明显，即使将外源DNA引入基因组，也不总是能够获得高表达的转化细胞。引入基因组的外源DNA的表达水平通常根据引入的位置而不同，并不总是能够有效地选择所需的转化细胞。
[0006]已提出定点整合(TI)作为能够解决将外源DNA引入基因组(专利文献1
‑
3)中的问题的技术之一。在TI中，预先确认适合外源DNA引入和表达的基因组区域，并将待表达的外源DNA位点特异性整合到确认的基因组区域中。TI可以说是随着基因组位点特异性重组技术的改进而产生的一种新的基因重组技术。作为TI的结果，获得的转化细胞的外源DNA等的表达水平的可预测性提高，并且可以预期有效获得具有所需性状的转化细胞。在TI中，适合引入外源DNA的基因组区域通常被称为热点。到目前为止，已经在用作用于转化的宿主细胞的各种细胞的基因组上的广泛区域中发现了热点。此外，还报道了将TI应用于通过动物细胞生产单克隆抗体以获得可用于生产的转化细胞的尝试(专利文献4，非专利文献1
‑
2)。
[0007][引文列表][0008][专利文献][0009][专利文献1]国际公开号：WO 2008/151219
[0010][专利文献2]国际公开号：WO 2013/190032
[0011][专利文献3]国际公开号：WO 2016/064999
[0012][专利文献4]国际公开号：WO 2017/184831
[0013][非专利文献][0014][非专利文献1]Biotechnol.Prog.，2015，第31卷，第6期，第1645
‑
1656页
[0015][非专利文献2]Methods 95(2016)第3
‑
12页

技术实现思路

[0016]技术问题
[0017]本公开的一个目的是提供用于定点整合(TI)的新热点。
[0018]解决方案
[0019]本专利技术人持续寻找能够在动物细胞中高水平表达编码诸如抗体的多肽的外源DNA的区域。在迄今为止报道的TI转化细胞的生产中，最初的表达水平并不能一直保持很长时间，有时在培养过程中表达水平最终会下降(PLoS ONE,2017 12(6):e0179902，Biotechnology Letters，2018，第40卷，第8期，第1209
‑
1218页)。当这种转化细胞用于生产多肽时，表达产物的生产量变得不稳定，生产效率会降低。或者，如果转化细胞无法维持工业生产水平，则需要重建生产线。本专利技术人怀疑培养物中多肽表达水平的降低可能取决于外源多核苷酸的基因组整合位点而发生。因此，本专利技术人等通过尝试寻找可以预期长期维持外源DNA表达水平的热点，成功地发现了新的热点，从而完成了本公开。
[0020]本公开具体包括以下实施方式：
[0021][1]一种将编码目标多肽的外源DNA引入CHO细胞的方法，该方法包括将外源DNA引入CHO细胞中由NCBI登录号NW_003614838.1指定的基因组区域；
[0022][2]根据[1]的方法，其中外源DNA的整合位点选自在由NCBI登录号NW_003614838.1指定的基因组区域中包含卷曲螺旋结构域蛋白91(CCDC91)基因及其启动子区域的区域；
[0023][3]根据[2]的方法，其中外源DNA的整合位点选自CCDC91基因区域；
[0024][4]根据[3]的方法，其中外源DNA的整合位点在CCDC91基因的第一内含子中；
[0025][5]根据[1]至[4]中任一项的方法，其中通过选自同源重组、重组酶介导的盒式交换(RMCE)和基因组编辑的任何方法将外源DNA位点特异性地引入基因组区域；
[0026][6]根据[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，目标多肽是抗原结合分子；
[0027][7]根据[6]的方法，其中，抗原结合分子是抗体。
[0028][8]一种生产CHO细胞或CHO细胞系的方法，其中，该方法包括将编码目标多肽的外源DNA引入CHO细胞中由NCBI登录号NW_003614838.1指定的基因组区域；
[0029][9]根据[8]的方法，其中外源DNA的整合位点选自在NCBI登录号NW_003614838.1指定的基因组区域中包含卷曲螺旋结构域蛋白91(CCDC91)基因及其启动子区域的区域；
[0030][10]根据[9]的方法，其中，所述外源DNA的整合位点选自CCDC91基因区域；
[0031][11]根据[10]的方法，其中外源DNA的整合位点在CCDC91基因的第一内含子中；
[0032][12]根据[8]至[11]中任一项的方法，其中通过选自同源重组、重组酶介导的盒式交换(RMCE)和基因组编辑的任何方法将外源DNA位点特异性地引入基因组区域；
[0033][13]根据[8]至[12]中任一项的方法，其中，目标多肽为抗原结合分子；
[0034][14]根据[13]的方法，其中，抗原结合分子是抗体；
[0035][15]一种生产CHO细胞或CHO细胞系的方法，其中，该方法包括将通过交换反应引入外源DNA的DNA盒引入CHO细胞中由NCBI登录号NW_003614838.1指定的基因组区域；
[0036][16]根据[15]的方法，其中DNA盒的整合位点选自在由NCBI登录号NW_003614838.1指定的基因组区域中包含卷曲螺旋结构域蛋白91(CCDC91)基因及其启动子区域的区域；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种将编码目标多肽的外源DNA引入CHO细胞的方法，其中所述方法包括将外源DNA引入CHO细胞中由NCBI登录号NW_003614838.1指定的基因组区域。2.一种生产多肽的方法，其中所述方法使用CHO细胞，在所述CHO细胞中编码目标多肽的外源DNA被引入由NCBI登录号NW_003614838.1指定的基因组区域。3.一种生产多肽的方法，包括以下步骤：(1)将编码目标多肽的外源DNA引入CHO细胞，其中将外源DNA引入CHO细胞基因组的由NCBI登录号NW_003614838.1指定的基因组区域；(2)培养其中引入了外源DNA的CHO细胞；和(3)回收目标多肽。4.根据权利要求3的方法，其中将编码目标多肽的外源DNA引入CHO细胞的步骤包括以下步骤(i)
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(ii)：(i)将用于通过交换反应引入外源DNA的DNA盒引入CHO细胞；和(ii)通过识别(i)的DNA盒作为靶位点的重组酶，将外源DNA引入由NCBI登录号NW_003614838.1指定的基因组区域。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述外源DNA的整合位点选自在由NCBI登录号NW_003614838.1指定的基因组区域中包含卷曲螺旋结构域的蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：小松将大，小村健太，若原裕二，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：