一种des-pGlubrazzein三位点突变体结构基因和生产甜蛋白的方法技术

一种des

【技术实现步骤摘要】
一种des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因和生产甜蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体而言，涉及一种des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因、表达载体、生产甜蛋白的方法及应用。

技术介绍

[0002]长期大量摄入糖类会导致代谢紊乱，引起肥胖、糖尿病、高血压和心脏病等等，在很多国家已经成为一大社会问题，严重威胁着人类生命健康。因此，目前在全球范围内，对具有良好口味特性的、天然的、无热量的甜味剂的需求一直在增加。而甜蛋白质的大规模生产并应用是有效的解决方案之一，因为摄入这些本质是蛋白质的甜味剂不会对身体健康产生不利的影响。Brazzein是目前已发现的八种植物源甜味蛋白质之一，是蔗糖和人造甜味剂等最有前途的替代品之一，也是目前学术研究和食品工业中较为合适的模型蛋白质。
[0003]天然brazzein是从西非植物Pentadiplandra brazzeana Baillon的成熟果实中分离出来的，是目前发现的最小的甜味蛋白质。天然brazzein有两种形态：主形态pGlu brazzein由54个氨基酸的单链(6.5kDa)和N端的焦谷氨酸(pGlu)组成，按摩尔计算比蔗糖甜约9,500倍；次要形态des
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pGlu brazzein的N端没有pGlu，比含pGlu的主形态甜约两倍。Brazzein的味道纯甜，没有酸、咸或苦味，其水溶性至少为50mg/ml，即>7.7mM。并且在pH 2.5
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8范围内于98℃下孵育2小时或在80℃下孵育4.5小时后，其甜味仍然存在，具有出色的热稳定性和酸碱耐受性。
[0004]由于brazzein出色的热稳定性和酸碱耐受性，研究者们对其突变体的研究主要集中在如何提高其甜度上。目前已有多个位点突变的报道，这些突变确定了brazzein中的许多残基在与甜味受体的相互作用的过程中很重要。刘波等人报道了在大肠杆菌中表达的des
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pGlu brazzein的甜度阈值约为1.5μg/ml。Joo
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Won Lee等人报道了大肠杆菌中pGlu brazzein的三位点突变体(H31R/E36D/E41A)的表达，其甜度阈值约为0.889μg/ml。
[0005]Brazzein很难从其天然来源中大量地获得，因此大规模的brazzein生产需要通过基因工程在生物反应器中表达。目前已有各种重组表达系统表达brazzein的报道，包括细菌、酵母、转基因植物和转基因小鼠。相对于其他生物反应器，转基因动物乳腺生物反应器具有巨大的潜力，并且已经成功用于表达植物来源的蛋白质，如奇异果甜蛋白、野生型brazzein和D12脂肪酸去饱和酶，这表明植物蛋白可以在哺乳动物细胞中表达。
[0006]目前尚未有用转基因动物乳腺生物反应器表达brazzein相关突变体的报道。因此，如果能将brazzein相关突变体用转基因动物乳腺生物反应器表达，将为推进植物源甜味蛋白质的工业化生产提供极大的帮助。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因、表达载体、生产甜蛋白的方法及应用，所构建的des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因可以在
泌乳期的转基因小鼠乳腺细胞中稳定表达并分泌至乳汁中，此方法的构建过程快速简单，诱导条件容易控制，并且甜度远远高于前期研究中获得的野生型des
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pGlu brazzein转基因小鼠的乳汁，后续无需进行重组蛋白分离纯化，生产成本低，能够大量生产。
[0008]本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0009]第一方面，本申请实施例提供一种des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因，所述des
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pGlu brazzein三位点突变体的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]第二方面，本申请实施例提供一种表达载体，所述表达载体为将前述des
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pGlu brazzein三位点突变体克隆至乳腺特异性表达载体pBC1，得到表达载体pBC1
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des
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pGlu
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brazzein。
[0011]第三方面，本申请实施例提供一种前述的des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因生产甜蛋白的方法，包括以下步骤，
[0012](1)合成des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因；
[0013](2)将步骤(1)得到的des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因克隆乳腺特异性表达载体pBC1，得到表达载体pBC1
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des
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pGlu
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brazzein；
[0014](3)将步骤(2)合成的pBC1
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des
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pGlu brazzein酶切，得到载体真核部分；
[0015](4)将步骤(3)得到的载体真核部分注射入受精卵，再将受精卵转入受体动物，分娩后得到模型动物；
[0016](5)收集模型动物的乳汁，得到brazzein甜蛋白。
[0017]第四方面，本申请实施例提供一种检测前述表达载体的引物，包括pb
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s和pb
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a，所述pb
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s的序列如SEQ ID NO.4所示，所述pb
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a的序列如SEQ ID NO.5所示。
[0018]第五方面，本申请实施例提供一种前述的des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因在生产brazzein甜蛋白中的应用。
[0019]第六方面，本申请实施例提供一种前述的表达载体在生产brazzein甜蛋白中的应用。
[0020]相对于现有技术，本专利技术的实施例至少具有如下优点或有益效果：
[0021]本专利技术提供的des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因，通过将山羊β
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乳球蛋白的信号肽编码序列与des
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pGlu brazzein三位点突变体(H31R/E36D/E41A)成熟肽编码序列拼接，再进行密码子优化，使其适合在小鼠细胞内稳定表达。本专利技术提供包含des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因的表达载体，该表达载体pBC1
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des
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pGlu
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brazzein为乳腺特异性表达载体，可在泌乳期的乳腺细胞中特异性地表达brazzein并分泌至乳汁中。本专利技术提供的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因，其特征在于，所述des
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pGlu brazzein三位点突变体的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因，其特征在于，所述des
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pGlu brazzein三位点突变体的cDNA序列的5
’
端依次拼接有Xho I酶切位点和Kozak序列，所述所述des
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pGlu brazzein三位点突变体的cDNA序列的3
’
端拼接有Xho I酶切位点，如SEQ ID NO.2所示。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为将权利要求1或2中所述des
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pGlu brazzein三位点突变体克隆至乳腺特异性表达载体pBC1，得到表达载体pBC1
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des
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pGlu
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brazzein。4.一种利用权利要求2所述的des
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pGlu brazzein三位点突变体结构基因生产甜蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤，(1)合成des
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pGlu brazzein三...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆睿，
申请(专利权)人：江苏食品药品职业技术学院，
类型：发明
国别省市：