孔制造技术

一种噬菌体DNA包装马达的经修饰的门户蛋白，其中所述经修饰的门户蛋白能够直接插入到膜中，并且其中与野生型门户蛋白相比，所述门户蛋白被修饰，使得所述门户蛋白的外表面上的一个或多个氨基酸残基被一个或多个其它氨基酸残基取代，和/或其中将一个或多个氨基酸残基插入在所述门户蛋白的外表面上以相较于野生型门户蛋白改变所述经修饰的门户蛋白的外表面疏水性。表面疏水性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】孔


[0001]本公开涉及经修饰的门户蛋白、包括经修饰的门户蛋白的膜和使用包括经修饰的门户蛋白的膜表征分析物的方法。

技术介绍

[0002]纳米孔感测是一种依赖于对分析物分子与离子传导通道之间的个别结合或相互作用事件的观察的分析物检测和表征方法。可以通过在电绝缘膜中放置纳米尺寸的单孔和测量在存在分析物分子的情况下通过孔的电压驱动的离子电流来产生纳米孔传感器。纳米孔内部或附近的分析物的存在将改变通过孔的离子流，从而引起在通道上测量的离子或电流改变。分析物的同一性通过其独特的电流特征揭露，尤其是电流块的持续时间和程度以及与孔相互作用期间电流电平的变化。分析物可以是有机和无机小分子以及包含多核苷酸、多肽和多糖的各种生物或合成大分子和聚合物。纳米孔感测可以揭露被感测分析物的同一性并执行单分子计数，而且还可以提供关于如核苷酸、氨基酸或聚糖序列等分析物组成以及碱基、氨基酸或聚糖修饰(如甲基化和酰化、磷酸化、羟基化、氧化、还原、糖基化、脱羧、脱氨等)的存在的信息。纳米孔感测可能允许快速且廉价的多核苷酸测序，从而提供数十到数万个碱基长度的多核苷酸的单分子序列读段。
[0003]生物来源的纳米孔基于天然存在的膜蛋白，并且可以通过使膜与经纯化的蛋白质接触并且向膜施加电压电位而插入到共聚物膜中。
[0004]phi29噬菌体gp10门户蛋白从gp10的12个亚基组装成螺旋桨状结构。所述门户蛋白的外径为14.6nm，高度为7.5nm。在最窄处，野生型通道为3.6nm。12个亚基中的每个亚基都具有细长的形状，其中包含中心αr/>‑
螺旋结构域，所述结构域由三螺旋束、α
‑
β基序和处于较宽C端的处的6重链SH3样结构域构成。门户蛋白不是天然的膜蛋白或离子通道，但已被提议作为用于表征分析物的纳米孔。为了插入到膜中，噬菌体phi29门户蛋白必须首先插入到脂质体中，所述脂质体然后与平面脂质双层融合。

技术实现思路

[0005]本文公开了自发地插入到膜中的经修饰的噬菌体门户蛋白。插入的门户蛋白可以用作纳米孔。
[0006]一方面，提供了一种能够直接插入到膜中的噬菌体DNA包装马达的经修饰的门户蛋白，其中所述门户蛋白的外表面上的一个或多个氨基酸残基被一个或多个其它氨基酸残基取代，和/或一个或多个氨基酸残基插入在所述门户蛋白的外表面上，以相较于野生型门户蛋白改变所述门户蛋白的外表面疏水性。与野生型门户蛋白相比，通过取代和/或插入引入一个或多个氨基酸残基可以增加或减少外表面疏水性。蛋白质的特定区域的外表面疏水性可以增加或减少。
[0007]由于门户蛋白通道由12个亚基组装，改变一个单体中的一个或多个残基将触发整个通道中的效应，其中突变存在于分子的同一平面。总体而言，门户蛋白由两个结构域构
成：翼结构域和茎结构域。茎结构域包括门户蛋白的翼下方的疏水带区域。
[0008]在一个实施例中，一个或多个引入的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于所述门户蛋白的中心疏水带区域中。一个或多个引入的氨基酸残基可以通过例如取代和/或插入引入。所述Phi29 DNA包装马达的所述门户蛋白的所述疏水带区的残基包含F24、I25、L28、F60、F128、P129和P132。在一个实施例中，这些位置中的任何一个或多个位置的一个或两个残基内的氨基酸，或类似门户蛋白中的一个或多个相应位置处的氨基酸，可以用比经取代的位置处天然存在的氨基酸疏水性更强的一个或多个氨基酸取代。在一个实施例中，疏水性氨基酸可以插入到这些位置中的任何一个或多个位置的一个或两个残基内，或者插入在类似门户蛋白中的一个或多个对应位置处。门户蛋白的每个亚基的N端残基处于疏水带区域中。在一个实施例中，所述一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于所述门户蛋白的N端的30个氨基酸内。例如，所述一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于与所述Phi29DNA包装马达的所述门户蛋白的R10、E14、R17、Q18和/或R22相对应的位置处，或处于类似门户蛋白内的对应位置处。
[0009]在一个实施例中，所述一个或多个引入的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于所述门户蛋白的亲水性顺式层和/或反式层中。所述门户蛋白的所述顺式层中的氨基酸残基的实例包含与所述Phi29 DNA包装马达的所述门户蛋白的翼结构域中的Q32、Y36、F52、K55、Q59、F60、Y62、N77、G78、A79、L80、S81、R84、R94、A96、S97、P98和Q101相对应的位置处。所述门户蛋白的所述反式层中的氨基酸残基的实例处于与所述Phi29 DNA包装马达的所述门户蛋白的茎结构域中的P129、T131、E135、Q168相对应的位置处。
[0010]在具体实施例中，所述门户蛋白的所述顺式层或反式层中的所述一个或多个引入的氨基酸残基中的处于与所述Phi29 DNA包装马达的所述门户蛋白的A79、E135和/或Q168相对应的位置处的至少一个氨基酸残基被修饰。
[0011]一方面，提供了一种能够直接插入到膜中的噬菌体DNA包装马达的经修饰的门户蛋白，其中在所述门户蛋白的外表面上引入一个或多个氨基酸残基，以在翼结构域的外侧上或茎结构域中引入分子的结合位点，所述分子与野生型门户蛋白相比改变所述门户蛋白的所述外表面的疏水性。所述结合位点可以通过用另一个氨基酸残基取代存在于所述门户蛋白的表面上的残基，或通过插入一个或多个氨基酸残基来引入。
[0012]在一个实施例中，引入到门户蛋白中以在翼结构域的外侧上或茎结构域中引入结合位点的一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基是半胱氨酸和/或非天然氨基酸。
[0013]在一个实施例中，引入到门户蛋白中以引入结合位点的一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于门户蛋白的亲水性顺式层和/或反式层中。所述门户蛋白的所述顺式层中的氨基酸残基的实例包含处于与所述Phi29 DNA包装马达的所述门户蛋白的翼结构域中的Q32、Y36、F52、K55、Q59、F60、Y62、N77、G78、A79、L80、S81、R84、R94、A96、S97、P98或Q101中的一个或多个相对应的位置处的那些氨基酸残基。所述门户蛋白的所述反式层中的氨基酸残基的实例包含处于与所述Phi29 DNA包装马达的所述门户蛋白的茎结构域中的P129、T131、E135或Q168相对应的位置处的那些氨基酸残基。
[0014]在具体实施例中，所述门户蛋白的所述顺式层或反式层中的所述一个或多个氨基酸残基中的处于与所述Phi29 DNA包装马达的所述门户蛋白的A79、E135和/或Q168相对应
的位置处的至少一个氨基酸残基被修饰以引入结合位点。
[0015]在一个实施例中，与所述野生型门户蛋白相比，改变所述门户蛋白的所述外表面的所述疏水性的所述分子是疏水性分子。示例性疏水性分子是包括卟啉、四苯基卟啉、原卟啉IX、八乙基卟啉、胆固醇、血红素或胆绿素的那些疏水性分子。
[0016]在一些实施例中，所述经修饰的门户蛋白通过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种噬菌体DNA包装马达的经修饰的门户蛋白，其中所述经修饰的门户蛋白能够直接插入到膜中，并且其中与野生型门户蛋白相比，所述门户蛋白被修饰，使得所述门户蛋白的外表面上的一个或多个氨基酸残基被一个或多个其它氨基酸残基取代，和/或其中将一个或多个氨基酸残基插入在所述门户蛋白的外表面上以相较于野生型门户蛋白改变所述经修饰的门户蛋白的外表面疏水性。2.根据权利要求1所述的经修饰的门户蛋白，其中所述一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于所述门户蛋白的中心疏水带区域中。3.根据权利要求1或2所述的经修饰的门户蛋白，其中与野生型门户蛋白相比，引入一个或多个氨基酸残基增加外表面疏水性。4.根据权利要求1到3中任一项所述的经修饰的门户蛋白，其中所述一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于与Phi29 DNA包装马达的门户蛋白的F24、I25、L28、F60、F128、P129和P132相对应的位置中的一个或多个位置的一个或两个氨基酸内的位置处。5.根据权利要求1到3中任一项所述的经修饰的门户蛋白，其中所述一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于所述门户蛋白的N端的约30个氨基酸内。6.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的门户蛋白，其中所述一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于与Phi29 DNA包装马达的门户蛋白的R10、E14、R17、Q18和R22相对应的位置处。7.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的门户蛋白，其中所述一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于所述门户蛋白的亲水性顺式层和/或反式层中。8.根据权利要求7所述的经修饰的门户蛋白，其中所述门户蛋白的顺式层中的所述一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于与Phi29 DNA包装马达的门户蛋白的Q32、Y36、F52、K55、Q59、F60、Y62、N77、G78、A79、L80、S81、R84、R94、A96、S97、P98和Q101相对应的位置处，和/或所述门户蛋白的反式层中的所述一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于与Phi29 DNA包装马达的门户蛋白的P129、T131、E135、Q168相对应的位置处。9.根据权利要求8所述的经修饰的门户蛋白，其中所述门户蛋白的顺式层或反式层中的所述一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于与Phi29 DNA包装马达的门户蛋白的A79、E135和/或Q168相对应的位置处。10.一种噬菌体DNA包装马达的经修饰的门户蛋白，其中所述经修饰的门户蛋白能够直接插入到膜中，其中在所述门户蛋白的外表面上引入一个或多个氨基酸残基，以在翼结构域的外侧上或茎结构域中引入分子的一个或多个结合位点，所述分子相较于野生型门户蛋白改变所述门户蛋白的外表面的疏水性。11.根据权利要求10所述的经修饰的门户蛋白，其中引入到所述门户蛋白中的所述一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基是半胱氨酸或非天然氨基酸。12.根据权利要求10或11所述的经修饰的门户蛋白，其中所述一个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基处于所述门户蛋白的亲水性顺式层和/或反式层中。13.根据权利要求12所述的经修饰的门户蛋白，其中所述门户蛋白的顺式层中的所述一...

【专利技术属性】
技术研发人员：法尔津，
申请(专利权)人：Pamp，amp，Z生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：