检测转基因蛋白的无标记型AuNPs-Thi电化学免疫传感器及其制备方法技术

检测转基因蛋白的无标记型AuNPs

【技术实现步骤摘要】
检测转基因蛋白的无标记型AuNPs
‑
Thi电化学免疫传感器及其制备方法


[0001]本专利技术属于食品安全免疫检测
，具体涉及一种检测转基因蛋白的无标记型AuNPs
‑
Thi电化学免疫传感器及其制备方法。

技术介绍

[0002]随着基因工程技术的不断发展，转基因作物的种植面积逐年扩大，其安全性成为人们关注的焦点。尽管我国对转基因作物及产品已经实施了强制性的标识条例，但仍有许多非法种植，销售转基因作物的案例发生。因此，开发一种简单，快速，高灵敏的转基因作物鉴定方法，对转基因作物及其产品的监管具有重要意义。
[0003]对转基因作物的检测中，基于核酸水平的检测，灵敏度高，但依赖仪器并对操作人员有一定的技术要求；基于蛋白质水平的检测方法，操作简单，检测时间短，对样品的前处理要求低，最适于目标物的现场快速检测。其中，免疫传感器具有可定量，特异性强，易操作等优点，目前已成为快速检测方法的研究热点。
[0004]在PAT蛋白的检测中，快速检测方法多依赖于免疫学技术，而免疫学速测技术，如免疫层析试纸条等，只能提供半定量的检测结果。迫切需要一种快速、灵敏、定量检测方法用于田间、仓储等环节的农作物的痕量检测。
[0005]基于PCR技术的检测方法灵敏度较高，但实验过程繁琐复杂且耗时长。免疫层析试纸条(ICS)能快速地的检测目标物，但其灵敏度偏低，且不能定量。电化学免疫传感器(electrochemiluminescence，ECL)具有较高的灵敏度，但传统的ECL试剂存在一些缺点，如高毒性及耗时长，现有转基因蛋白的不同检测方法性能比较见表1。
[0006]表1转基因蛋白的不同检测方法性能比较。
[0007][0008][0009]电化学免疫传感器可分为无标记型和标记型免疫传感器，因其灵敏度高，操作简
单而备受关注。标记型免疫传感器虽然灵敏度较高，但在分析过程中需要用其他电活性物质对抗体或抗原进行标记。而无标记型免疫传感器，无需对抗体或抗原进行标记，通过简单的抗原
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抗体特异性反应即可实现对目标样品的快速检测。
[0010]与标记型免疫传感器相比，无标记型免疫传感器制备过程简单，具有低成本，易于微型化，快速，简便等优势，广泛应用于各个领域的免疫分析中，是一种具有较高应用前景的定量检测方法。
[0011]Wang Z等(A novel oriented immunosensor based on AuNPs
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thionine
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CMWCNTs and staphylococcal protein A for interleukin
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6 analysis in complicated biological samples[J].Analytica Chimica Acta.2020,1140:145
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152)开发了基于AuNPs/Thi/CMWCNTs(羧化多壁碳纳米管)的免疫传感器用于高灵敏检测白细胞介素
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6(IL
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6)，该方案中选取3种材料形成的复合材料修饰电极，也可达到高灵敏检测目标物的目的，但多壁碳纳米管修饰电极时易产生聚集现象，可能会导致构建的免疫传感器平行性较差。

技术实现思路

[0012]本专利技术的目的在于提供一种检测转基因蛋白的无标记型AuNPs
‑
Thi电化学免疫传感器及其制备方法，通过在GCE表面电沉积AuNPs，后吸附适量硫堇(Thi)构建了免疫传感器，增大了电极表面积和生物固载量，可以显著增强免疫传感器中的电化学信号，该方法简单，快速，所需抗体量少，且具有较高的灵敏度、良好的特异性和重现性，为电化学免疫检测转基因作物中的转基因蛋白提供了一种新方法。
[0013]为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0014]一种检测转基因蛋白的无标记型AuNPs
‑
Thi电化学免疫传感器，其工作电极为玻碳电极，所述玻碳电极表面电沉积金纳米粒子AuNPs，硫堇Thi通过静电吸附作用稳定吸附在AuNPs表面形成AuNPs
‑
Thi膜；转基因蛋白
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mAb抗体共价结合于AuNPs
‑
Thi膜上，以3
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5％BSA为封闭剂。
[0015]进一步，所述金纳米粒子AuNPs的用量为：以1
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1.5％HAuCl4溶液沉积3
‑
4圈，电位范围为：0V～1.1V，50mV/s，所述硫堇Thi的用量为5
‑
10μg。
[0016]又，所述转基因蛋白
‑
mAb抗体的用量为2.5
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3μg，所述封闭剂BSA的用量为5
‑
10μL。
[0017]优选地，所述转基因蛋白为PAT蛋白，所述转基因蛋白
‑
mAb抗体为PAT
‑
mAb抗体。
[0018]本专利技术提供所述检测转基因蛋白的无标记型AuNPs
‑
Thi电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0019]1)将清洗后的玻碳电极浸泡在HAuCl4溶液中，通过循环伏安法(Cyclic voltammetry，CV)在电极表面电沉积金纳米粒子；
[0020]2)随后采用滴涂法将5
‑
10μL Thi在室温下修饰于沉积有金纳米粒子的玻碳电极表面，Thi通过静电吸附作用稳定吸附在AuNPs表面形成AuNPs
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Thi膜，并用0.25
‑
0.5％戊二醛室温活化30
‑
45min；
[0021]3)接着将转基因蛋白
‑
mAb抗体滴加至步骤2)活化后的电极表面进行修饰，30
‑
37℃孵育40
‑
60min；
[0022]4)在电极表面滴加3
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5％BSA，30
‑
37℃放置40
‑
60min，封闭非特异性结合位点，洗
涤、室温干燥，获得检测转基因蛋白的无标记型AuNPs
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Thi电化学免疫传感器。
[0023]进一步，步骤1)中，HAuCl4溶液的浓度为1
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1.5％，电沉积3
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4圈；步骤2)中，使用的Thi为0.75
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1.0mg/mL的硫堇溶液，0.5％戊二醛的室温活化时间为30min；步骤3)中，转基因蛋白
‑
mAb抗体的用量为2.5μg，步骤4)中，5％BSA的用量为5μL。
[0024]又，采用循环伏安法对电极的制备过程进行表征，以[Fe(CN)6]3‑
/4‑
作为氧化还原探针，CV扫描范围为
‑
0.2V～0.6V，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测转基因蛋白的无标记型AuNPs
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Thi电化学免疫传感器，其工作电极为玻碳电极，所述玻碳电极表面电沉积金纳米粒子AuNPs，硫堇Thi通过静电吸附作用稳定吸附在AuNPs表面形成AuNPs
‑
Thi膜；转基因蛋白
‑
mAb抗体共价结合于AuNPs
‑
Thi膜上，以3
‑
5％BSA为封闭剂。2.根据权利要求1所述的无标记型AuNPs
‑
Thi电化学免疫传感器，其特征在于，所述金纳米粒子AuNPs的用量为：以1
‑
1.5％HAuCl4溶液沉积3
‑
4圈，电位范围为：0V～1.1V，50mV/s，所述硫堇Thi的用量为5
‑
10μg。3.根据权利要求1所述的无标记型AuNPs
‑
Thi电化学免疫传感器，其特征在于，所述转基因蛋白
‑
mAb抗体的用量为2.5
‑
3μg，所述封闭剂BSA的用量为5
‑
10μL。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的无标记型AuNPs
‑
Thi电化学免疫传感器，其特征在于，所述转基因蛋白为PAT蛋白，所述转基因蛋白
‑
mAb抗体为PAT
‑
mAb抗体。5.如权利要求1所述检测转基因蛋白的无标记型AuNPs
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Thi电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：1)将清洗后的玻碳电极浸泡在HAuCl4溶液中，通过CV法在电极表面电沉积金纳米粒子；2)随后采用滴涂法将5
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10μL Thi在室温下修饰于沉积有金纳米粒子的玻碳电极表面，Thi通过静电吸附作用稳定吸附在AuNPs表面形成AuNPs
‑
Thi膜，并用0.25
‑
0.5％戊二醛室温活化30
‑
45min；3)接着将转基因蛋白
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mAb抗体滴加至步骤2)活化后的电极表面进行修饰，...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾海娟，王金斌，杨倩雯，
申请(专利权)人：上海瑞丰农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：