一种基于核酸外切酶辅助放大光电化学适配体传感器制造技术

本发明专利技术公开的一种基于核酸外切酶辅助放大光电化学适配体传感器的制备方法及应用，水浴沉积的方法在与预处理过的FTO上沉积WO3，煅烧后冷却，将WO3/FTO电极浸入HAuCl4溶液，煅烧后得Au/WO3/FTO电极。将活化的互补cDNA滴在Au/WO3/FTO电极上，孵化过夜。用Tris

【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸外切酶辅助放大光电化学适配体传感器


[0001]本专利技术属于电化学检测领域，指一种光电化学适配体传感器及其制备方法，并用于食源性致病菌的快速检测。

技术介绍

[0002]单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是李斯特菌属的8个菌种中对人类致病能力最强的菌种。LM是一种革兰氏阳性小杆菌，其引起的食源性李斯特菌病相对少见但十分严重，是致死率非常高的食源性致病菌。
[0003]LM在0～45℃都能生存，生命力非常顽强，存在于牛奶、奶制品、鸡蛋、家禽和肉类中。在冰箱的冷藏温度4～6℃下仍可以大量生长繁殖，这意味着食物在冰箱内冷藏也无法将LM置于死地，也是该菌不同于其它食源性致病菌的重要特征。
[0004]目前研究最多的LM快速检测技术主要是PCR技术、实时荧光定量PCR技术、环介导等温扩增技术、酶联免疫吸附技术和免疫层析试纸条。PCR技术和实时荧光定量PCR技术操作过程较为繁琐，需要具有专业技术的操作人员，所需设备和试剂价格昂贵。LAMP法灵敏度高、特异性强、快速高效，但检测过程很容易被污染，造成假阳性。酶联免疫吸附技术在检测效率、特异性上同样具有优势，但由于LM的抗体制备时间较长，成本也比较高，具有一定的局限性。前由于检测环境的多样性和检测标准的不一致性，导致各类传感器的检测灵敏度和特异性产生了较大波动，并且没有合适的检测值确定方法和标准。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种快速简便、灵敏度较高的光电化学适配体传感器，用于LM的检测。本专利技术整合了纳米材料制备、量子点敏化、适配体分子识别、核酸外切酶I辅助循环等技术，构建光电化学适配体传感器，建立了一种快速简便、准确灵敏的LM检测方法。
[0006]本专利技术完整的技术方案包括：
[0007]一种基于核酸外切酶辅助放大光电化学适配体传感器及其检测单增李斯特菌的方法，其步骤如下：
[0008]步骤1、制备WO3/FTO电极
[0009]将FTO电极先后用丙酮、氢氧化钠、去离子水清洗，烘干备用。将0.4g Na2WO4·
2H2O和0.17g(NH4)2C2O4·
H2O溶解于33mL去离子水中，搅拌10min后，加入9mL HCl溶液(37％)。再搅拌10min加入8mL H2O2(30％)，继续搅拌20min，加入30mL无水乙醇并搅拌30min。将预处理的FTO导电玻璃导电面朝下，倾斜45
°
靠近烧杯杯壁，置于上述溶液中，放入水浴锅中一定温度下保持200min。降至室温后，用去离子水冲洗干净，然后置于60℃干燥箱中干燥6h。最后用马弗炉一定温度下煅烧2h，冷却至室温后用去离子水冲洗并干燥，得到WO3/FTO电极。
[0010]步骤2、CdTe QDs的制备
[0011]0.2mmol的CdCl2·
2.5H2O溶解于50mL去离子水中，然后加入18μL巯基乙酸并搅拌
10min，然后用2M NaOH调节pH。将0.04mmol的K2TeO3溶解于50mL去离子水中，充分搅拌后加入上述溶液中，并搅拌20min。然后加入80mg NaBH4充分反应5min。然后将烧瓶连接冷凝器在100℃条件下冷凝一定时间。冷却至室温后离心洗涤，最后加入等量去离子水置于4℃冰箱中保存。
[0012]步骤3、CdTe QDs
‑
Ap偶联物的制备
[0013]400μL CdTe QDs用40μL含有40mM EDC和10mM NHS的溶液在室温下活化1h，然后加入300μL一定浓度的LM适配体(Ap)溶液中，持续搅拌过夜。所得溶液在4℃离心除去过量Ap，即得到CdTe QDs
‑
Ap偶联物。
[0014]步骤4、构建光电化学适配体传感器工作电极
[0015]首先将WO3/FTO电极浸入0.01M HAuCl4(pH＝4.5)溶液中50min，于300℃下煅烧2h形成金纳米颗粒，得Au/WO3/FTO电极。
[0016]将2μM LM适配体的互补DNA(cDNA)用三(2
‑
羧乙基)膦(TCEP)(0.6μL，10mM)活化1h，滴在Au/WO3/FTO电极上。在4℃下孵化过夜，并用Tris
‑
HCl(pH＝7.4，10mM)缓冲液冲洗，然后用30μL 6
‑
羟基
‑1‑
己硫醇(MCH)封闭1h。Tris
‑
HCl冲洗后，将30μL CdTe QDs
‑
Ap偶联物滴在电极上，并在37℃下孵育1h使Ap与cDNA杂交。用Tris
‑
HCl溶液冲洗后即得工作电极。
[0017]步骤5、构建检测单核增生李斯特菌的光电化学适配体传感器
[0018]将步骤4制备的工作电极插入电解槽中，再将饱和甘汞电极和铂对电极插入，组成三电极体系，外接电化学工作站，辅以氙灯光源系统模拟太阳光，即组装成了光电化学适配体传感器，用于单核增生李斯特菌的光电化学检测。
[0019]步骤1中，水浴锅温度为70
‑
90℃，马弗炉煅烧温度为300
‑
800℃。
[0020]步骤2中，溶液pH值为10
‑
11.5，冷凝时间为1
‑
10h。
[0021]步骤3中，LM适配体浓度为1
‑
5μM。
[0022]本专利技术所构建的检测LM的光电化学适配体传感器是基于CdTe量子点敏化与Exo
‑
I的辅助循环作用来放大信号，其优点以及特色如下：
[0023](1)Au/WO3复合结构为工作电极的基底材料，能吸收模拟太阳光产生光电流，Au纳米粒子可以靠Au
‑
S键，将适配体互补链修饰在电极上，还可以增大光电流强度。
[0024](2)利用CdTe QDs作为敏化剂敏化Au/WO3，实现信号放大，再利用Exo
‑
I辅助循环作用实现进一步的信号放大。未孵化时，量子点产生敏化作用，光电流强度响应增强。而当适配体传感器在LM和Exo
‑
I中孵化后，量子点远离电极表面，敏化作用大大减弱，光电流强度也显著降低。
[0025](3)通过LM菌体和其适配体的特异性结合，大大提高了实验的准确性以及特异性。提出的检测标准方法能够迅速灵敏且低成本确定LM菌体的浓度含量，相对现有技术检测快、具有良好的线性响应特征以及良好的特异性。
[0026](4)LM检测时间短，成本低廉，潜在的便携性。
[0027](5)生物传感器作为新型的检测手段，与传统的检测手段相比，其背景信号与检测信号分离，具有良好的灵敏度、简便性和快速性，可实现现场快速检测。光电活性材料和生物识别探针是构建光电化学传感器的基本要素。与抗体等检测元件相比，适配体具有亲和性好、成本低、特异性强等特点。
附图说明<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸外切酶辅助放大光电化学适配体传感器检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、制备WO3/FTO电极将掺杂氟的SnO2导电玻璃(FTO)先后用丙酮、氢氧化钠、去离子水清洗，烘干备用。将0.4g Na2WO4·
2H2O和0.17g(NH4)2C2O4·
H2O溶解于33mL去离子水中，搅拌10min后，加入9mL HCl溶液(37％)。再搅拌10min加入8mLH2O2(30％)，继续搅拌20min，加入30mL无水乙醇并搅拌30min。将预处理的FTO导电面朝下，倾斜45
°
靠近烧杯杯壁，置于上述溶液中，放入水浴锅中一定温度下保持200min。降至室温后，用去离子水冲洗干净，然后置于60℃干燥箱中干燥6h。最后用马弗炉一定温度下煅烧2h，冷却至室温后用去离子水冲洗并干燥，得到WO3/FTO电极；步骤2、CdTe量子点(CdTe QDs)的制备0.2mmol的CdCl2·
2.5H2O溶解于50mL去离子水中，然后加入18μL巯基乙酸并搅拌10min，然后用2M NaOH调节pH。将0.04mmol的K2TeO3溶解于50mL去离子水中，充分搅拌后加入上述溶液中，并搅拌20min。然后加入80mg NaBH4充分反应5min。然后将烧瓶连接冷凝器在100℃条件下冷凝一定时间。冷却至室温后离心洗涤，最后加入等量去离子水置于4℃冰箱中保存；步骤3、CdTe QDs
‑
适配体(CdTe QDs
‑
Ap)偶联物的制备400μL CdTe QDs用40μL含有40mM 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和10mM N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液在室温下活化1h，然后加入300μL一定浓度的单核增生李斯特菌(LM)适配体(Ap)溶液中，持续搅拌过夜。所得溶液在4℃离心除去过量Ap，即得到CdTe QDs
‑
Ap偶联物；步骤4、构建光电化学适配体传感器工作电极首先将WO3/FTO电极浸入0.01M HAuCl4(pH＝4.5)溶液中50min，于300℃下煅烧2h形成金纳米颗粒，得Au/WO3/FTO电极。将2μM LM适配体的互补DNA(cDNA)用三(2
‑
羧乙基)膦(TCEP)(...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝洪顺，朱良良，赵一睿，李畅，丁超，甘寒薇，侯红漫，张公亮，毕景然，闫爽，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：