一种基于PMA-双重ddPCR的副溶血性弧菌定量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于PMA

【技术实现步骤摘要】
一种基于PMA
‑
双重ddPCR的副溶血性弧菌定量检测方法


[0001]本专利技术属于食品安全检测
，具体涉及一种基于PMA
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双重ddPCR的副溶血性弧菌定量检测方法。

技术介绍

[0002]副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,Vp)是一类广泛分布于鱼类、贝类及虾蟹类等水产品中的杆状或弯曲状革兰氏阴性菌。饮用受污染的水以及食用生的或未煮熟的水产品会导致弧菌病的产生，尤其是免疫力低下的老人和小孩。据统计，每年美国由弧菌病导致的疾病达8万例，其中约4.5万由副溶血性弧菌引起。在我国，国家食品安全风险评估中心对全国食源性疾病暴发监测数据进行统计分析后发现，微生物性食源性疾病一直是引发我国食品安全问题的重要原因，其中副溶血性弧菌是最常见的食源性致病菌之一。目前，针对副溶血性弧菌的检测主要依赖于现行国家标准GB 4789.7
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2013的检验方法，大体步骤包括前增菌、选择性培养基分离、纯培养、生化反应和血清型分型，整个流程一般需要5～7d。
[0003]当前，有关副溶血性弧菌快速检测方法的研究主要仍是以传统毒力因子、DNA旋转酶等作为特异性鉴定靶点建立起来的，由于副溶血性弧菌基因组包含两套染色体，在检测过程中，往往只检测其中1套染色体，再加上引物设计不当，在实际检测过程中常常存在误检的情况，影响结果的准确性。本实验室前期试验发现，在以tlh基因鉴定副溶血性弧菌时发现某些溶藻弧菌也能检测出tlh基因阳性。同样，也有技术人员发现某些哈维氏弧菌也能检测出tlh基因阳性，出现结果误判的情况。
[0004]微滴式数字PCR(ddPCR)是继普通PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)之后的第三代PCR技术，是一项基于单分子目标基因PCR扩增的绝对定量技术。其原理是在PCR反应前将含有模板DNA的反应体系微滴化，把模板DNA分子分散在大约20000个“油包水”微滴中，使大部分微滴中只含有1个DNA分子数，PCR扩增后读取荧光信号(有荧光信号记为1，无荧光信号记为0)，依据泊松分布原理或阳性微滴的比例计算样本的起始浓度或拷贝数。与qPCR相比，ddPCR是终点检测，具有更高耐受性、灵敏度、准确性和精确度。
[0005]食物样品中除含有正常活菌细胞外，通常还携带有大量的死亡细胞，其DNA却能够稳定存在，而PCR技术是以核酸扩增为基础建立起来的，因此仅凭PCR技术无法区分活菌和死菌，易造成“假阳性”结果。叠氮溴化丙锭(PMA)是一种具有高亲和力的光敏性DNA结合染料，与叠氮溴化乙锭(EMA)均属于叠氮类染料，它们作用原理相似。活细胞的细胞膜完整，PMA被阻隔在胞外，不与核酸反应。非活细胞的细胞膜大多有不同程度损伤，PMA即可穿入破碎的细胞膜，与DNA发生不可逆共价交联，体系中残余的染料与水分子再经光照反应生成无活性的羟胺化合物，而不会对后续活细胞DNA扩增造成影响。

技术实现思路

[0006]由于副溶血性弧菌基因组包含两套染色体，在检测过程中，往往只针对其中1套染色体选择检测的靶基因，再加上引物设计不当，在实际检测过程中常常存在误检的情况，造
成“假阴性”，影响结果的准确性，进一步导致食品安全隐患。
[0007]为了解决上述问题，本专利技术提供一种基于副溶血性弧菌自筛特异性新靶点VP0488和传统靶点TLH设计特异性引物和探针，并结合PMA去除死菌的特性，建立副溶血性弧菌PMA
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双重ddPCR定量检测方法及应用，以弥补现有技术中的不足。
[0008]为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0009]本专利技术的第一个目的在于提供一种检测试剂，包括引物组合A和引物组合B，所述引物组合A针对副溶血性弧菌1号染色体上的vp0488基因，所述引物组合B针对副溶血性弧菌2号染色体上的tlh基因；
[0010]所述引物探针需满足在同一个PCR反应体系中同时进行两个目的基因的扩增，因此较单个普通引物的设计更为复杂，需要经过生物信息软件综合评估后筛选获得，从而保证所设计的引物探针具有高度特异性和广泛适用性。主要遵循以下五个原则：(1)选择相对保守的序列设计引物探针，扩增产物大小为80～150bp，两个基因的扩增产物大小不应相差太大；(2)综合考虑发夹结构、二聚体、错配等重要因素，优选质量良好的引物探针；(3)探针的Tm值要比引物的Tm值高5～10℃，两个基因的引物探针Tm值要接近，差值控制在3℃以内；(4)确保两对引物之间和探针之间互不干扰；(5)将所设计好的引物探针使用NCBI的Nucleotide BLAST和Primer
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BLAST在线工具进行初步验证。
[0011]所述引物组合A包括上游引物，下游引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如下所示：
[0012]上游引物：TTGAGTATTCAAGGTGCTTTGTAT；
[0013]下游引物：CATCAATCATCCACTCGGTAG；
[0014]探针：CTGCGAATTTGACTGCTGAGGCT；
[0015]所述探针的5
’
端用FAM修饰，3
’
端用BHQ1修饰；其中，FAM表示荧光报告基团，BHQ1表示淬灭基团；
[0016]所述引物组合B包括上游引物，下游引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如下所示：
[0017]上游引物：GTGCGAAAGTGCTTGAGATG；
[0018]下游引物：TCGAACAAGGCGTGAGTATC；
[0019]探针：CGAGTTCATCAAGGCACAAGCGA；
[0020]所述探针的5
’
端用HEX修饰，3
’
端用BHQ1修饰；其中，HEX表示荧光报告基团，BHQ1表示淬灭基团。
[0021]本专利技术的第二个目的是提供一种检测试剂盒，所述试剂盒包括所述检测试剂。
[0022]在一种实施方式中，所述试剂盒还包括ddPCR扩增反应所需的辅助试剂和叠氮溴化丙锭(PMA)。
[0023]本专利技术第三个目的是提供一种检测副溶血性弧菌的方法，所述方法为，使用PMA预处理待测样本，并利用所述检测试剂或所述检测试剂盒进行双重ddPCR检测。
[0024]在一种实施方式中，所述PMA的初始浓度为28～32μmol/L。
[0025]在一种实施方式中，所述预处理为将PMA与待测样本混匀并避光孵育不少于5min后，光照处理不少于15min。
[0026]在一种实施方式中，所述光照的强度为40～500W。
[0027]在一种实施方式中，所述双重ddPCR的反应体系中，总体系为20μL，包括：ddPCR Supermix for Probes(No dUTP)10μL，引物组合A和引物组合B的上、下游引物各1.0μL，探针各0.5μL，DNA模板4μL，最后用水补足至20μL。
[0028]在一种实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测试剂，其特征在于，包括引物组合A和引物组合B，所述引物组合A包括上游引物，下游引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如下所示：上游引物：TTGAGTATTCAAGGTGCTTTGTAT；下游引物：CATCAATCATCCACTCGGTAG；探针：CTGCGAATTTGACTGCTGAGGCT；所述探针的5
’
端用FAM修饰，3
’
端用BHQ1修饰；其中，FAM表示荧光报告基团，BHQ1表示淬灭基团；所述引物组合B包括上游引物，下游引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如下所示：上游引物：GTGCGAAAGTGCTTGAGATG；下游引物：TCGAACAAGGCGTGAGTATC；探针：CGAGTTCATCAAGGCACAAGCGA；所述探针的5
’
端用HEX修饰，3
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端用BHQ1修饰；其中，HEX表示荧光报告基团，BHQ1表示淬灭基团。2.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测试剂。3.根据权利要求2所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ddPCR扩增反应所需的辅助试剂和叠氮溴化...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨军，周海波，刘新梅，别小妹，程逸宇，吴海晶，刘延，
申请(专利权)人：南京市食品药品监督检验院，
类型：发明
国别省市：