一种乳品防伪溯源的组学分析方法技术

本发明专利技术公开了一种乳品防伪溯源的组学分析方法，属于化学分析领域。本发明专利技术所述乳品防伪溯源的组学分析方法包括如下步骤：(1)提取乳品中的脂质，并以SWATH模式采集样品中化合物的UHPLC

【技术实现步骤摘要】
一种乳品防伪溯源的组学分析方法


[0001]本专利技术涉及一种乳品防伪溯源的组学分析方法，属于化学分析领域。

技术介绍

[0002]乳品是最重要的食品之一，而脂质是乳品的重要组成部分。脂质不仅能提供能量，发挥特殊的营养作用，还能作为乳品溯源的重要依据。将超高效液相色谱(Ultra
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high performance liquid chromatography,UHPLC)和质谱(Mass Spectrometry,MS)相结合的非靶向脂质组学方法已成为乳品脂质分析最受欢迎和常用的手段。通过高分辨质谱的数据依赖性采集(Information Dependent Acquisition,IDA)获得无偏倚、高覆盖性的化合物二级质谱(MS/MS)信息用于定性，利用一级质谱(MS1)信息进行定量已经成为常用的脂质分析策略。但是由于仪器平台的缺陷，非靶向分析往往受限于线性范围和精确性。而靶向分析所采用的三重四级杆质谱(Triple Quadrupole Mass Spectrometry,TQMS)作为定量分析的黄金标准，具有更广的线性范围和精确性，却由于其覆盖性不足而难以应用于非靶向组学的研究。拟靶向策略将非靶向平台的无偏倚性和高覆盖性，与靶向平台的优秀定量能力相结合，使得组学研究同时获得良好的覆盖性和定量能力，是改善脂质非靶向分析的最佳选择。然而，拟靶向策略需要在不同质谱仪上进行数据采集，一定程度上引入了误差，并且增加了单个样品的分析时间，不利于大批量样品的分析研究。SWATH技术(Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical fragment ions)是一种数据非依赖性采集技术(Data Independent Acquisition,DIA)，它通过将样品中所有母离子按照质荷比划分为不同窗口，将同一窗口内所有母离子全部破碎而获得二级信息，相比于IDA，具有覆盖性更强、二级碎片采集更完整等特点。由于同时碎裂了所有母离子并采集了完整的碎片离子信息，SWATH具有通过二级碎片定量的潜力。
[0003]此外，样品处理、仪器状态等误差对于样品数据后续的统计学分析结果也造成很大的影响。对于分析条件波动较大、处理批次不同的样品，系统误差对结果的影响甚至高于样品本身的差异，这对实验结果的分析非常不利。基于全球天然产物社区分子网络(Global Natural Products Social Molecular Networking,GNPS,https://gnps.ucsd.edu/)的Qemistree技术将化学树的概念引入代谢组和脂质组学中，类比于微生物组分析中进化树的概念，将样品中化合物的结构相似性纳入数据的分析中，显著降低了系统误差对于分析结果的影响，有利于获得更加可信的统计学结果。

技术实现思路

[0004][技术问题][0005]由于仪器平台的缺陷，非靶向分析往往受限于线性范围和精确性；拟靶向策略需要在不同质谱仪上进行数据采集，一定程度上引入了误差，并且增加了单个样品的分析时间，不利于大批量样品的分析研究。
[0006][技术方案][0007]为了解决上述至少一个问题，本专利技术提出了一种基于UHPLC
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SWATH
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MS/MS和Qemistree的乳品防伪溯源的组学分析方法，通过SWATH
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MS/MS同时进行高覆盖、高质量的定性与定量，之后将基于化学树的Qemistree引入到乳品脂质的防伪溯源模型中，对于提高数据采集的质量和效率，以及改善后续统计学分析的可信性和有效性具有重要意义。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种基于UHPLC
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SWATH
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MS/MS和Qemistree的乳品防伪溯源的脂质组学分析方法，包括以下步骤：
[0009](1)提取乳品中的脂质，并以SWATH模式采集样品中化合物的UHPLC
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SWATH数据；
[0010](2)利用软件对步骤(1)得到的UHPLC
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SWATH数据进行去卷积、色谱峰识别和色谱峰对齐，通过数据库比对鉴定化合物，并挑选出脂质，形成脂质列表；
[0011](3)通过步骤(2)脂质列表与步骤(1)得到的UHPLC
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SWATH数据筛选特征离子对，并验证特征离子对的可用性，得到验证后的特征离子对列表；
[0012](4)利用步骤(1)得到的UHPLC
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SWATH数据，结合步骤(3)中验证后的特征离子对列表提取定量数据，并采用Qemistree的统计学分析方法进行分析，得到基于Qemistree的主坐标分析(PCoA)结果，即：乳品溯源的脂质组学分析结果。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)所述提取乳品中的脂质是采用液液萃取法提取乳品中的脂质。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)所述提取乳品中的脂质具体是：
[0015]将乳粉和水以1:10～1:20的质量比复溶；或将液态乳按干重和水质量比1:10～1:20进行稀释，得到液态样品；
[0016]在50μL～100μL液态样品中加入氯仿和甲醇的混合溶液1～2mL，超声混匀后加入超纯水0.15～0.25mL，超声混匀；离心、取下层有机相，干燥、复溶，得到(单个)脂质样品；之后将不同的脂质样品取等体积混合，形成混合样品；其中氯仿和甲醇的混合溶液中氯仿和甲醇的体积比为2:1；离心是10kr/min离心10～15min；干燥是氮气吹干；复溶是采用异丙醇复溶。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)所述的以SWATH模式采集样品中化合物的UHPLC
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SWATH数据，具体为：
[0018]采集单个或混合样品中的数据，形成UHPLC
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SWATH数据；之后在质谱自带的数据处理软件中打开UHPLC
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SWATH数据，提取UHPLC
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SWATH
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MS1图谱观察单一化合物的峰宽，按照每个峰采集10到15个点的原则确定数据采集的Cycle time；再根据公式Cycle time＝MS1accumulation time+SWATH窗口数*MS2 accumulation time+模式切换时间，依次确定SWATH采集参数；其中MS1 accumulation time大于150ms，MS2 accumulation time大于45ms。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)所述的UHPLC
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SWATH数据的采集中UHPLC部分是采用Thermo Hypersil GOLD C18柱(100*2.1mm,1.9μm)，流动相A为乙腈：水＝3:2，流动相B为异丙醇：乙腈＝9:1，均添加10mM乙酸铵为缓冲盐，流速为0.3mL/min，进样量为1μL，柱温为4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于UHPLC
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SWATH
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MS/MS和Qemistree的乳品防伪溯源的脂质组学分析方法，包括以下步骤：(1)提取乳品中的脂质，并以SWATH模式采集样品中化合物的UHPLC
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SWATH数据；(2)利用软件对步骤(1)得到的UHPLC
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SWATH数据进行去卷积、色谱峰识别和色谱峰对齐，通过数据库比对鉴定化合物，并挑选出脂质，形成脂质列表；(3)通过步骤(2)得到的脂质列表与步骤(1)得到的UHPLC
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SWATH数据筛选特征离子对，并验证特征离子对的可用性，得到验证后的特征离子对列表；(4)利用步骤(1)得到的UHPLC
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SWATH数据，结合步骤(3)中验证后的特征离子对列表提取定量数据，并采用Qemistree的统计学分析方法进行分析，得到基于Qemistree的主坐标分析结果，即：乳品溯源的脂质组学分析结果。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述提取乳品中的脂质具体是：将乳粉和水以1:10～1:20的质量比复溶；或，将液态乳按干重和水质量比1:10～1:20进行稀释，得到液态样品；在50μL～100μL液态样品中加入氯仿和甲醇的混合溶液1～2mL，超声混匀后加入超纯水0.15～0.25mL，超声混匀；离心、取下层有机相，干燥、复溶，得到脂质样品；之后将不同的脂质样品取等体积混合，形成混合样品；其中氯仿和甲醇的混合溶液中氯仿和甲醇的体积比为2:1。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的以SWATH模式采集样品中化合物的UHPLC
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SWATH数据，具体为：采集单个或混合样品中的数据，形成UHPLC
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SWATH数据；之后在质谱自带的数据处理软件中打开UHPLC
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SWATH数据，提取UHPLC
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SWATH
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MS1图谱观察单一化合物的峰宽，按照每个峰采集10到15个点的原则确定数据采集的Cycle time；再根据公式Cycle time＝MS1 accumulation time+SWATH窗口数*MS2 accumulation time+模式切换时间，依次确定SWATH采集参数；其中MS1 accumulation time大于150ms，MS2 accumulation time大于45ms。4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述色谱峰的强度阈值为1000～3000amplitude，Mass slice width为0.05或0.1Da，Sigma window value为0.4～0.6，二级质谱背景噪音阈值为10～30amplitude，同位素离子范围为0.5Da。5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中筛选特征离子对是借助R语言包SWATHtoMRM筛选特征离子对，根据仪器状...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘元法，孙贤，徐勇将，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：