一种裂解酶在制备低聚原花青素中的应用以及蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法技术

本发明专利技术提供了一种裂解酶在制备低聚原花青素中的应用以及蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，涉及生物转化技术领域。所述裂解酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1～5中的一种。蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，包括以下步骤：葡萄籽用水浸泡后进行爆破处理，得到爆破样品；对所得爆破样品进行脱脂，得脱脂样品；将所得脱脂样品和提取液混合进行提取，得到高聚原花青素粗提物；将所得高聚原花青素粗提物和裂解酶混合，无氧条件下反应，得低聚原花青素。本申请所述制备低聚原花青素的方法具有高聚原花青素降解工艺简单、反应条件温和、环境污染小以及低聚原花青素得率高等优点。优点。优点。

【技术实现步骤摘要】
一种裂解酶在制备低聚原花青素中的应用以及蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法


[0001]本专利技术涉及生物转化
，尤其涉及一种裂解酶在制备低聚原花青素中的应用以及蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法。

技术介绍

[0002]葡萄籽占葡萄总重量的3
‑
6％，是葡萄酒、葡萄饮料等产业的主要副产品，自然资源丰富。据统计，中国每年的葡萄产量达到一千多万吨，主要用与葡萄酒和葡萄饮料等生产，而剩下的葡萄籽无法被充分利用，造成巨大的资源浪费。葡萄籽中含有大量的原花青素(含量3.9％)，葡萄籽中的原花青素主要存在于外珠被中，并被木质素、蛋白质、纤维素、以及半纤维素紧密包裹，此外原花青素还与细胞组分、基质等具有较强的相互作用。原花青素主要由儿茶素(Catechin，CA)、表儿茶素(Epicatechin，EC)、表儿茶没食子酸酯(Epicatechin 3
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O
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gallate，ECG)通过C4
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C8或者C4
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C6键聚合而成。然而葡萄籽中原花青素的50％以上为不可提取的原花青素(聚合度较高)，与细胞等其他组分相互作用较强，而可提取原花青素中的高聚原花青素(DP≥5)占比达到65％以上。因此将高聚原花青素转化为能被人吸收的低聚原花青素或单体意义重大。
[0003]原花青素(Procyanidin，PC)是一种类黄烷醇物质，是一类植物中广泛存在多酚类化合物。研究表明，原花青素是一种强大的抗氧化剂，其抗自由基氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍，是国际上公认的清除人体内自由基有效的天然抗氧化剂。此外，原花青素在预防和治疗由自由基引发的衰老等疾病以及治疗心脏病和癌症方面也表现出重要应用潜力。天然原花青素是由不同的单体形成的聚合度不一的混合物。根据聚合度(Degree of polymerization，DP)的不同，将聚合度>4的称作高聚原花青素(Polymeric procyanidins，PPC)，聚合度≤4的称为低聚原花青素(Oligomeric procyanidins，OPC)。体内代谢研究显示，原花青素主要是通过肠道微生物的分解作用而被人体吸收，进一步研究发现，肠道微生物的分解作用只针对原花青素单体和二聚体，随着原花青素聚合度增多，分解作用将大大降低。因此，只有低聚的原花青素才能被人体吸收并发挥其抗氧化活性。
[0004]目前，PPC的降解方法主要有氧化降解法、酸性降解法、碱性降解法和氢化降解法等。中国专利CN1654463A公开了利用双氧水或氯酸钾作为氧化剂降解高聚原花青素，然而双氧水和氯酸钾在使用和储藏过程中不稳定、易分解，因而催化效率低下，且耗费较大，易引起原花青素酚羟基氧化形成副产物。此外，中国专利CN101012216A利用酸性催化剂如硫酸、盐酸或强酸性树脂等催化降解从葡萄籽等中提取的高聚原花青素，但是无论酸性还是碱性降解法，其中所用到的酸或碱都会对设备造成腐蚀，排放也会污染环境，并且会导致原花青素分子结构(尤其是具有生物活性的酚羟基)被破坏，导致活性降低。中国专利CN101544703A采用氢化降解金荞麦中高聚原花青素，主要通过在惰性气体并高压高温环境下进行反应，反应要求较高且操作不便。中国专利CN109096237A公开了利用一种季铵盐类离子液体催化降解高聚原花青素的方法，尽管离子液体催化是一种绿色过程，但是在离子
液体的制备中会使用一些化学试剂，后者会产生较多污染；此外，高纯度离子液体的制备目前挑战也较大。总之，现有的高聚原花青素降解方法缺点明显，如成本太高、降解率低、污染环境等。因此，开发酶法降解高聚原花青素制备低聚原花青素对于低聚原花青素的规模化制备意义重大，可有效降低生产成本、减少环境污染并提高高聚原花青素的降解率。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种裂解酶在制备低聚原花青素中的应用以及蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，克服了葡萄籽原花青素提取率低以及传统低聚原花青素生产中环境污染严重、底物转化率低、工艺复杂等不足。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种裂解酶在通过催化高聚原花青素C4
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C8或C4
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C6键断裂，制备低聚原花青素中的应用，所述裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1～5中的一种。
[0008]本专利技术提供了一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，包括以下步骤：
[0009]葡萄籽用水浸泡后进行爆破处理，得到爆破样品；
[0010]对所得爆破样品进行脱脂，得脱脂样品；
[0011]将所得脱脂样品和提取液混合进行提取，得到高聚原花青素粗提物；
[0012]将所得高聚原花青素粗提物和裂解酶混合，无氧条件下反应，得低聚原花青素。
[0013]优选的，所述葡萄籽为60～200目粉末。
[0014]优选的，所述浸泡时间为20～50min。
[0015]优选的，爆破处理具体为在2.5～3.5Mpa的压力下维持90～120s，0.00087s内将压力泄出。
[0016]优选的，脱脂处理中，所得爆破样品与石油醚的固液比为1～5g：20～100mL，在50～250rpm下震荡脱脂2～8h。
[0017]优选的，高聚原花青素粗提物的提取为脱脂样品与提取液以固液比1～3g：15～30mL混合，20～35℃，10～30kHZ，超声处理15～30min。
[0018]优选的，所述提取液为丙酮、水和乙酸的混合溶液，丙酮、水和乙酸的体积比为72.5～75:24.5～26.5:0.5～3。
[0019]优选的，超声处理后，在室温避光条件下，震荡提取1～2h。
[0020]优选的，所述反应的温度为25～50℃，时间为1～2h，pH值为5.0～7.0。
[0021]本专利技术提供了一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，克服了葡萄籽原花青素提取率低以及传统低聚原花青素生产中环境污染严重、底物转化率低、工艺复杂等不足。
[0022]本专利技术通过蒸汽爆破促进了葡萄籽中原花青素的释放，进一步提高原花青素的提取率至24.5mg/g，并联合裂解酶降解高聚原花青素制备低聚原花青素，高聚原花青素转化率高达82.8％。具有原花青素提取率高、高聚原花青素降解工艺简单、反应条件温和、环境污染小以及低聚原花青素得率高等优点。
附图说明
[0023]图1为原花青素单体及原花青素聚合体结构式(CA为儿茶素、EC为表儿茶素、ECG为表儿茶没食子酸酯、EGC为表没食子儿茶素、Procyanidin为原花青素类)
具体实施方式
[0024]本专利技术提供了一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，包括以下步骤：
[0025]葡萄籽用水浸泡后进行爆破处理，得到爆破样品；
[0026]对所得爆破样品进行脱脂，得脱脂样品；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种裂解酶在通过催化高聚原花青素C4
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C8或C4
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C6键断裂，制备低聚原花青素中的应用，所述裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1～5中的一种。2.一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：葡萄籽用水浸泡后进行爆破处理，得到爆破样品；对所得爆破样品进行脱脂，得脱脂样品；将所得脱脂样品和提取液混合进行提取，得到高聚原花青素粗提物；将所得高聚原花青素粗提物和裂解酶混合，无氧条件下反应，得低聚原花青素。3.根据权利要求2所述的一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，葡萄籽为60～200目粉末。4.根据权利要求2或3所述的一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，浸泡时间为20～50min。5.根据权利要求2所述的一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，爆破处理具体为在2.5～3.5Mpa的压力下维持90～120s，0.00087s内将压力泄出。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：袁其朋，张杰，王文雅，程磊雨，刘新力，刘旭东，李静，马荣荣，石晔，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：