一种制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法技术

本发明专利技术中提供了一种制备(S)

【技术实现步骤摘要】
一种制备(S)
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(3
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吡啶)
‑
吡咯烷的方法


[0001]本专利技术属于生物催化领域，涉及一种利用来源于粘球菌属的亚胺还原酶为生物催化剂，以NADP(H)为辅酶，还原2
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吡啶
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吡咯啉生成(S)
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吡啶)
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吡咯烷的方法，产物光学纯度>98％。

技术介绍

[0002]手性胺及其衍生物是单一对映体药物的重要分支，是众多医药中间体及农用化学品的结构单元，目前有超过70％的药物都是手性胺及其衍生物，包括神经类、抗高血压及心脑血管等药物[Mitsukura K,Kuramoto T,Yoshida T,et al.[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97：8079
‑
8086.]。
[0003][0004]X＝C,O,N,S；
[0005]R＝Cl,F,Br,I,CH3,OCH3,OH,NO2[0006][0007]X＝C,N；
[0008]R＝Cl,F,Br,I,CH3,OCH3,OH,NO2[0009]光学纯的2
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芳(杂)基吡咯烷是重要的结构单元，常见于天然产物、药物分子以及合成中间体中，功能化的手性吡咯烷类化合物最近被证明具有多种生物活性，特别是作为治疗帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和图雷特综合征方面的潜在的有益化合物前体[Viswanath A,Joseph L,[J]ACS Comb.Sci.2017,19,286
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298]。此外，许多手性2
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芳(杂)基吡咯烷是天然产物，可用作手性碱、手性助剂和手性配体。因此，近年来对光学纯的2
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芳(杂)基吡咯烷衍生物的合成受到了广泛的关注[Andres,J.M,Sierra,I.H,et al.[J]European Journal of Inorganic Chemistry 2000,9,1719
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1726.]。
[0010]手性胺的不对称合成方法主要包括化学法合成或生物酶催化法合成，使用化学法合成手性2
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芳(杂)基吡咯烷需要多步反应，期间会用到手性衍生试剂或者金属催化剂等才能完成，条件苛刻，污染严重，光学纯度难以达到98.0％以上，收率较低，在实际大规模生产中有诸多限制[Charles H.M.,Steven J.Q.[J]Journal of Medicinal Chemistry,2017,19,286
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298]。因此，探索更加绿色高效的生物酶催化法显得尤为重要。
[0011]手性胺的生物酶催化法常用的酶主要包括转氨酶[Fuchs M,Kozelewski D,etal.[J].Chem Commun,2010,46(30)：5500
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5502]、单胺氧化酶[Ghislieri D,Turner N.[J].Topics in Catalysis,2014,57(5)：284
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300]、脱氢酶[Abrahamson MJ,Wong JW,[J].Advanced Synthesis&Catalysis,2013,355(9)：1780
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1786]和亚胺还原酶[Mangassanchez J,France SP,Montgomery SL,et al.[J].Current Opinion in Chemical Biology,2016,37：19
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25.]等。相比其他几种酶，亚胺还原酶具有催化合成手性仲胺和叔胺的独特优势[Lenz M,Borlinghaus N,Weinmann L,et al.[J].World J Microbiol Biotechnol,2017,33(11)：199]，近几年来逐渐成为生物催化合成手性胺的研究热点。2018年，黄冈等人利用重组亚胺还原酶催化合成了R构型的吡咯烷，(R)
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(2,5
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二氟苯基)吡咯烷或其盐[CN201811582029.X]。
[0012]但是由于胺类底物独特的性质，导致在还原过程中底物浓度往往不能过高，否则反应转化率会明显降低，为了提高底物浓度，需要增加昂贵辅酶NAD(P)H的用量，生产成本较高。因此寻找更高活性的亚胺还原酶通成为了高效还原亚胺底物2
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吡啶
‑1‑
吡咯啉的关键因素。

技术实现思路
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[0013]本专利技术中提供了一种制备(S)
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吡啶)
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吡咯烷的方法，利用亚胺还原酶(IRED)或表达该酶的工程菌制备手性2
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吡啶吡咯烷化合物。利用葡萄糖脱氢酶/葡萄糖体系实现辅酶的再生。
[0014][0015]2‑
吡啶
‑1‑
吡咯啉化合物结构式
[0016][0017]本专利技术中所述的产亚胺还原酶的基因工程菌，具体的构建方法是：对来源于Myxococcus fulvus的MsIR1(WP_074958336.1)基因进行密码子优化后全合成相对应序列，并在基因两端加上Nde I和EcoR I酶切位点，并将合成的基因构建到相应表达载体中，然后表达载体转化入受体菌，即分别得到所述的产亚胺还原酶的基因工程菌M1；并对基因工程菌进行发酵培养，实现了亚胺还原酶的高效异源表达。
[0018]本专利技术中所述产亚胺还原酶的基因工程菌所用到的载体系列包括：pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。
[0019]本专利技术中所述的产亚胺还原酶的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的宿主菌为下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。
[0020]在本专利技术中，由质粒转化宿主得到的转化体可以基于已知信息生长并产生本专利技术所述的亚胺还原酶。任何一种人工的或天然的含有合适碳源、氮源、无机和其他营养物质的
介质，只要能满足宿主菌体的生长并且能够表达出目的蛋白均可使用。培养方法和培养条件没有明确的限制，可以根据培养方法和类型等的不同而进行适当的选择，只要能满足宿主生长并能产生相应活性的亚胺还原酶即可。
[0021]用于制备本专利技术的手性2
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(3
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吡啶)
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吡咯烷的亚胺还原酶可以是上述亚胺还原酶基因工程重组菌的培养物，也可以是通过将培养基离心后得到的菌体细胞或其加工制品。其中加工制品指的是菌体得到的提取物、破碎液、或者对提取物亚胺还原酶进行的分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化提取物或者加工制品的固定化制品。
[0022]本专利技术还涉及全细胞或粗酶液转化合成手性2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备(S)
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吡啶)
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吡咯烷的方法，通过亚胺还原酶催化2
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吡啶
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吡咯啉化合物得到(S)
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吡啶)
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吡咯烷，其特征在于，包括如下步骤：(a)将亚胺还原酶基因工程菌在发酵培养基中扩增培养，诱导产生目的蛋白后，离心收集菌体；(b)将收集的重组菌体细胞或对重组菌体破菌得到的粗酶液加入到缓冲液中，并加入2
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吡啶
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吡咯啉进行反应；(c)反应完全后从反应体系中收集上层清液，并使用无机碱调节pH值；(d)使用有机溶剂萃取，合并有机相；(e)使用干燥剂干燥有机相，过滤，旋蒸回收溶剂得到目标产物。2.如权利要求1所述的制备(S)
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吡啶)
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吡咯烷的方法，其特征在于，所述的亚胺还原酶来源于Myxococcus fulvus，其氨基酸序列为SEQ ID.NO 1。3.如权利要求2所述的制备(S)
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吡啶)
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吡咯烷的方法，其特征在于，所述亚胺还原酶的基因工程菌所用到的载体系列为pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列或pTYB系列。4.如权利要求3所述的制备(S)
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(3
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吡啶)
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吡咯烷的方法，其特征在于，所述的亚胺还原酶的基因工程菌的宿主菌为BL21系列、Rosetta系列、Origami系列或Tuner系列。5.如权利要求1所述的制备(S)
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【专利技术属性】
技术研发人员：李家全，魏庚辉，孟宪强，
申请(专利权)人：恒信永基科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：